Rilevamento della contaminazione batterica mediante nanosensori magnetofluorescenti

Abstract

Fonte: Shelby, T., Sulthana, S., McAfee, J., Banerjee, T., Santra, S. Screening dei patogeni di origine alimentare utilizzando un nanosensore magnetofluorescente: rilevamento rapido di E. coli O157:H7. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra una tecnica per rilevare contaminanti batterici in campioni di cibo e acqua utilizzando nanosensori. I batteri patogeni bersaglio vengono rilevati attraverso una combinazione di modalità di rilassamento magnetico e di emissione di fluorescenza.

Protocollo

1. Rilevamento rapido di E. coli O157:H7 utilizzando MFnS

1. Addizionare varie soluzioni di PBS (1X, pH 7,4, 300 μL) con quantità crescenti del ceppo batterico ^10-6, ottenendo intervalli di CFU da 1 a 100. A queste soluzioni si aggiunge una quantità costante di MFnS (100 μL).
2. Creare una soluzione di base che contenga solo PBS (1X, pH 7,4, 300 μL) e MFnS (100 μL).
3. Incubare le soluzioni per 30 minuti a 37 °C e lasciarle raffreddare a temperatura ambiente.
4. Trasferire le singole soluzioni al rilassometro magnetico (0,47 Tesla) e registrare le variazioni dei tempi di rilassamento (T2) rispetto ai CFU in ciascuna soluzione.
   1. Per registrare le variazioni dei valori T2, iniziare misurando il valore T2 della soluzione di base che contiene solo PBS e MFnS.
      1. Inserire la soluzione nel relaxometro magnetico. Aprire il rispettivo software, selezionare l'impostazione "Rilassamento T2" e premere "misura".
      2. Dopo la raccolta del T2 basale, misurare i valori di T2 delle soluzioni aggiuntive che sono state addizionate con varie concentrazioni di batteri.
         nota: La variazione di T2 è equivalente al basale T2 sottratto dal T2 spiked.
5. Prelevare i campioni dal rilassometro magnetico e centrifugare le provette a 2880 x g per 10 min.
6. Decantare il surnatante e risospendere i pellet batterici in 100 μL di PBS (1X, pH 7,4).
7. Aggiungere 80 μl di ciascuna risospensione a una piastra a 96 pozzetti e registrare le intensità di fluorescenza a 595 nm.
   nota: I test possono essere ripetuti utilizzando diversi solventi, tra cui acqua di lago, latte e altri, come descritto nella sezione dei risultati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro ferroso tetraidrato	Fisher Scientifico	I90-500
Cloruro ferrico esaidrato	Fisher Scientifico	I88-500
Idrossido di ammonio	Fisher Scientifico	A669S-500
acido cloridrico	Fisher Scientifico	A144S-500
Acido poliacrilico	Sigma-Aldrich	Codice 323667-100G
Edc	Thermofisher Scientifico	Codice 22980
Nhs	Fisher Scientifico	AC157270250
Anticorpo anti-E. coli O111	Sera care	Codice: 5310-0352
Anticorpo anti-E. coli O157:H7 [P3C6	Abcam	ab75244
DiI Macchia	Fisher Scientifico	D282
Brodo nutriente	Difco	Codice 233000
Pellet di E. coli liofilizzato O157:H7	ATCC	700728
Relaxomteter magnetico	Bruker	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Lettore di targhe	Tecan	Infinito M200 PRO
Colonna magnetica	QuadroMACS	Codice 130-090-976
centrifuga	Eppendorf	Serie 5804
Centrifuga (accuSpin Micro 17)	Fisher Scientifico	13-100-676
Modello da pavimento Incubatore a scuotimento	LABORATORIO SHEL	SSI5
Bilancia analitica	Metler Toledo	ME104E
Miscelatore digitale a vortice	Fisher Scientifico	02-215-370
Agitatore a dondolo all'aperto	Fisher Scientifico	02-217-765