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1. Preparazione dei reagenti
- Terreno dei sali biliari: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente lo 0,4% di sali biliari (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 ml di TSB autoclavato. Il filtro sterilizza utilizzando un filtro da 0,22 μm. Prepara un fresco medio settimanale.
Note: I sali biliari abitualmente utilizzati sono una miscela 1:1 di colato di sodio e desossicolato di sodio isolati dalla cistifellea ovina e bovina. Come dimostrato in precedenza, la presenza di glucosio era necessaria per la formazione del biofilm indotta dal sale biliare. TSB ha aggiunto glucosio rispetto al brodo Luria-Bertani (LB); e quindi, è stato sufficiente per indurre la formazione di biofilm in Shigella e negli altri patogeni enterici analizzati. A seconda dei batteri da analizzare, potrebbero essere necessarie diverse concentrazioni di glucosio o diversi requisiti di zucchero.
- 0,5% p/v cristallovioletto in acqua: sciogliere 2,5 g di cristallovioletto in 500 ml di acqua distillata. Sterilizzare con filtro da 0,22 μm.
2. Preparazione dei batteri
- Coltivare colture notturne dei ceppi batterici da testare inoculando 3 ml di TSB con una singola colonia ben isolata in una provetta di coltura sterile. Incubare a 37 °C con agitazione a 225 rpm per incubazione notturna (16 - 24 h).
nota: I ceppi devono essere recuperati dalle scorte di congelamento ogni 2-4 settimane e mantenuti su piastre di non più di 2 settimane.
3. Saggio di aderenza in fase solida
NOTA: Questo test quantifica i batteri aderenti utilizzando un metodo di piastra a 96 pozzetti. I batteri vengono coltivati staticamente in piastre a fondo piatto. Il lavaggio viene eseguito per rimuovere i batteri non aderenti e i batteri aderenti vengono colorati con cristallovioletto. La colorazione cristallovioletta lega il peptidoglicano nella parete cellulare batterica e può essere solubilizzata utilizzando l'etanolo. Il numero di batteri aderenti è determinato in base alla ritenzione di cristallovioletto.
- Installare due provette da 1,5 mL. Etichettare con TSB o TSB + sali biliari (BS).
- Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS alle rispettive provette.
- Inoculare le provette con 20 μl di coltura notturna (a una diluizione di 1:50).
- In una piastra a 96 pozzetti sterile, trasparente, a fondo piatto e trattata con coltura tissutale, aggiungere 130 μL/pozzetto di terreno di controllo non inoculato a tre pozzetti per fungere da controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di fluido (TSB e TSB + BS) da testare.
- Aggiungere 130 μL/pozzetto di coltura inoculata in tre pozzetti e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono state piastrate in triplicato.
- Incubare per 4 - 24 ore a 37 °C staticamente.
- Utilizzando un lettore di piastre, registrare l'OD600. Impostare i pozzetti di controllo su "vuoto". Verificare che il mezzo di controllo sia chiaro senza segni di torbidità. Se viene rilevata una torbidità, scartare l'esperimento. I valori di OD600 possono essere utilizzati per normalizzare i dati se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra i ceppi batterici.
- Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea per il vuoto, inclinando delicatamente la piastra e aspirando lentamente il terreno sul bordo inferiore del pozzetto. Assicurarsi di raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione batterica aderente situata sulla superficie della plastica. Se la matrice di polisaccaridi extracellulari (EPS) è stata prodotta durante il periodo di incubazione, la matrice sarà visualizzata come un precipitato bianco. Non disturbare la matrice EPS.
- Lavare delicatamente i pozzetti una volta con 200 μl di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere il lavaggio PBS utilizzando la linea di aspirazione.
- Capovolgere la piastra per asciugare. Lasciare asciugare per almeno 20 minuti.
nota: Poiché il biofilm deve essere accuratamente asciugato prima della colorazione, il protocollo può essere messo in pausa in questa fase per alcune ore o anche durante la notte. Il tempo di asciugatura aggiunto non altererà la procedura di colorazione, mentre un'asciugatura incompleta influirà sulla quantificazione dei risultati e sulla riproducibilità.
- Aggiungere 150 μl di cristallovioletto allo 0,5% a ciascun pozzetto sperimentale e di controllo.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Lavare i pozzetti una volta con 400 μL di acqua distillata. Il volume aggiunto aiuta a rimuovere la macchia di cristallovioletto residua dai lati dei pozzetti. Rimuovere il lavaggio con la linea dell'aspirapolvere.
- Lavare i pozzetti cinque volte con 200 μL di acqua distillata. Rimuovere il lavaggio con la linea di aspirazione.
nota: Un lavaggio accurato è importante per la quantificazione. Quando i pozzetti del bianco sono liberi dall'acqua distillata e non contengono alcuna macchia di cristallovioletto residui, procedere al passaggio successivo.
- Capovolgere la piastra per asciugare, al riparo dalla luce. Assicurarsi che la piastra si asciughi completamente come indicato sopra.
- Macchiare i pozzetti con 200 μL di etanolo al 95%. Incubare la piastra sullo shaker per 30 minuti. Per evitare l'evaporazione, in particolare a temperature più elevate, eseguire questa fase a 4 °C.
- Utilizzando un lettore di piastre, registrare la densità ottica a 540 (OD540).
nota: La lunghezza d'onda per l'assorbanza massima del cristallovioletto è vicina a 590 nm. La letteratura riporta un intervallo da OD540 a OD595 per l'assorbanza del cristallovioletto; Scegliere quindi una lunghezza d'onda disponibile in base al lettore di piastre.