1. Preparazione dei reagenti
- Sali biliari (BS) medium: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente lo 0,4% di sali biliari (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 ml di TSB autoclavato. Sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Prepara un fresco medio settimanale.
Note: I sali biliari abitualmente utilizzati sono una miscela 1:1 di colato di sodio e desossicolato di sodio isolati dalla cistifellea ovina e bovina. Come dimostrato in precedenza, la presenza di glucosio era necessaria per la formazione del biofilm indotta dal sale biliare. TSB ha aggiunto glucosio rispetto al brodo Luria-Bertani (LB); e quindi, è stato sufficiente per indurre la formazione di biofilm in Shigella e negli altri patogeni enterici analizzati. A seconda dei batteri da analizzare, potrebbero essere necessarie diverse concentrazioni di glucosio o diversi requisiti di zucchero.
- 0,5% p/v cristallovioletto in acqua: sciogliere 2,5 g di cristallovioletto in 500 ml di acqua distillata. Sterilizzare con filtro da 0,22 μm.
- Concanavalina A (ConA) coniugata all'isotiocianato di fluoresceina (FITC): ricostituire lo stock in 1x PBS. Diluire il brodo concentrato da 10 mg con 400 μL di 1x PBS a una concentrazione finale di 25 μg/mL e proteggere dalla luce.
- PBS + glucosio: Sciogliere 0,2 g di glucosio in 10 ml 1x PBS (2% p/v glucosio finale). Sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Preparare fresco il giorno dell'uso.
- PBS + sali biliari: sciogliere 40 mg in 10 ml 1x PBS (0,4% p/v sali biliari finale). Sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Preparare fresco il giorno dell'uso.
- PBS + glucosio e sali biliari: sciogliere 40 mg di sali biliari e 0,2 g di glucosio in 10 ml 1x PBS (0,4% p/v sali biliari e 2% p/v glucosio finale). Sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Preparare fresco il giorno dell'uso.
- Preparare le piastre di agar LB.
- Fissazione formaldeide/glutaraldeide: aggiungere 810 μL di formaldeide (soluzione madre al 37%, concentrazione finale al 3%) e 125 μL di glutaraldeide (soluzione madre al 25%, concentrazione finale allo 0,25%) a 14 mL di PBS. Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C. La correzione dovrebbe essere fredda per un uso corretto.
cautela: La soluzione è tossica e richiede lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
- Soluzione montante antidissolvenza: utilizzare una soluzione montante antisbiadimento contenente la colorazione 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per inibire il fotosbiancamento dei campioni di microscopia immunofluorescente mentre colora in modo fluorescente il DNA dei batteri.
2. Preparazione dei batteri
- Coltivare colture notturne dei ceppi batterici da testare inoculando 3 ml di TSB con una singola colonia ben isolata in una provetta di coltura sterile. Incubare a 37 °C con agitazione a 225 rpm per incubazione notturna (16 - 24 h).
nota: I ceppi devono essere recuperati dalle scorte di congelamento ogni 2-4 settimane e mantenuti su piastre non più vecchie di 2 settimane.
3. EPS Rilevamento Matrice
NOTA: Questi saggi complementari quantificano e visualizzano l'EPS. In entrambi, l'EPS viene rilevato utilizzando una lectina per legare i polisaccaridi. La proteina coniugata in fluorescenza consente la quantificazione.
- Rilevamento semiquantitativo dell'EPS
- Installare due provette da 1,5 mL. Etichettare con TSB o TSB + BS.
- Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS alle rispettive provette.
- Inoculare le provette con 20 μl di coltura notturna (diluizione 1:50).
- In una piastra a 96 pozzetti sterile, nera, a fondo piatto, trattata con coltura tissutale, aggiungere 130 μL/pozzetto di terreno di controllo non inoculato a tre pozzetti per fungere da controllo in bianco. Predisporre tre pozzetti di controllo per ogni tipo di terreno da testare. Aggiungere 130 μL/pozzetto di coltura inoculata ai pozzetti e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali non sono state piastrate in triplicato.
- Incubare per 4 - 24 ore a 37 °C staticamente.
- Trasferire il terreno di coltura in una piastra trasparente a 96 pozzetti con una pipetta, idealmente una pipetta multicanale. Fai attenzione a raccogliere tutto il terreno di coltura senza disturbare la popolazione aderente e/o l'EPS situato sulla superficie di plastica. Accantonare.
- Fissare la piastra nera per 15 minuti a RT utilizzando 200 μL/pozzetto di formaldeide/glutaraldeide in 1x PBS.
- Mentre la popolazione aderente si sta fissando, valutare la frazione surnatante dal passaggio 1.1.6. Utilizzando un lettore di piastre, registrare l'OD600. Impostare i pozzetti di controllo su "vuoto". Verificare che il mezzo di controllo sia chiaro senza segni di torbidità. Se viene rilevata una torbidità, scartare l'esperimento.
- In alternativa, l'intero test può essere eseguito in una piastra a fondo nero trasparente. In tali circostanze, i valori di OD600 possono essere registrati e il terreno di coltura può essere successivamente scartato prima di procedere al passaggio 3.1.7. I valori di OD600 possono essere utilizzati per normalizzare i dati nel caso in cui ci siano differenze significative nel tasso di crescita tra i ceppi batterici.
- Rimuovere il fissaggio e smaltirlo nei rifiuti pericolosi.
- Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 μL/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio PBS utilizzando la linea di aspirazione inclinando delicatamente la piastra e aspirando lentamente il lavaggio sul bordo inferiore del pozzetto.
- Aggiungere 150 μL/pozzetto di 25 μg/mL di ConA-FITC e incubare per 15 minuti a RT.
- Lavare delicatamente due volte con 200 μL di PBS.
- Aggiungere 150 μl di PBS a ciascun pozzetto. Registrare la fluorescenza a 488 nm.
