1. Preparazione dei reagenti
- Terreno dei sali biliari: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente lo 0,4% di sali biliari (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 ml di TSB autoclavato. Sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Prepara un fresco medio settimanale.
Note: I sali biliari abitualmente utilizzati sono una miscela 1:1 di colato di sodio e desossicolato di sodio isolati dalla cistifellea ovina e bovina. Come dimostrato in precedenza, la presenza di glucosio era necessaria per la formazione del biofilm indotta dal sale biliare. TSB ha aggiunto glucosio rispetto al brodo Luria-Bertani (LB); e quindi, è stato sufficiente per indurre la formazione di biofilm in Shigella e negli altri patogeni enterici analizzati. A seconda dei batteri da analizzare, potrebbero essere necessarie diverse concentrazioni di glucosio o diversi requisiti di zucchero.
- 0,5% p/v cristallovioletto in acqua: sciogliere 2,5 g di cristallovioletto in 500 ml di acqua distillata. Il filtro sterilizza utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) + glucosio: sciogliere 0,2 g di glucosio in 10 ml 1x PBS (2% p/v glucosio finale). Il filtro sterilizza utilizzando un filtro da 0,22 μm. Preparare fresco il giorno dell'uso.
- PBS + sali biliari: sciogliere 40 mg in 10 ml 1x PBS (0,4% p/v sali biliari finale). Sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Preparare fresco il giorno dell'uso.
- PBS + glucosio e sali biliari: sciogliere 40 mg di sali biliari e 0,2 g di glucosio in 10 ml 1x PBS (0,4% p/v sali biliari e 2% p/v glucosio finale). Il filtro sterilizza utilizzando un filtro da 0,22 μm. Preparare fresco il giorno dell'uso.
- Preparare le piastre di agar LB.
2. Preparazione dei batteri
- Coltivare colture notturne dei ceppi batterici da testare inoculando 3 ml di TSB con una singola colonia ben isolata in una provetta di coltura sterile. Incubare a 37 °C con agitazione a 225 rpm per incubazione notturna (16 - 24 h).
nota: I ceppi devono essere ritolti dalle scorte di congelamento ogni 2-4 settimane e mantenuti su piastre non più vecchie di 2 settimane.
3. Saggio di dispersione
NOTA: In questo test, viene rilevato il disassemblaggio del biofilm attraverso la dispersione batterica. Qui si stabiliscono biofilm maturi e successivamente (di solito il giorno successivo) i terreni vengono sostituiti con PBS o PBS integrato. Il componente surnatante viene quindi valutato per quantificare il numero di batteri che si sono dissociati dal biofilm.
- Installare due provette da 1,5 mL. Etichettare con TSB o TSB + BS (sali biliari).
- Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS alle rispettive provette.
- Inoculare le provette con 20 μl di coltura notturna (a una diluizione di 1:50).
- In una piastra a 96 pozzetti sterile, trasparente, a fondo piatto e trattata con coltura tissutale, aggiungere 130 μL/pozzetto di terreno di controllo non inoculato a tre pozzetti per fungere da controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di terreno da testare.
- Aggiungere 130 μL/pozzetto di coltura inoculata a tre pozzetti e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono state piastrate in triplice copia.
- Incubare la piastra per 4 - 24 ore a 37 °C staticamente.
- Prima di continuare, riscaldare il PBS, il PBS + glucosio, il PBS + sali biliari e il PBS + sali biliari + glucosio a 37 °C. Preparare questi reagenti freschi ogni giorno.
- Utilizzando un lettore di piastre, registrare la densità ottica, OD600. Impostare i pozzetti di controllo su "vuoto". Verificare che il fluido sia chiaro senza segni di torbidità. Se viene rilevata una torbidità, scartare l'esperimento. I valori di OD600 possono essere utilizzati per normalizzare i dati se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra i ceppi batterici.
- Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea per vuoto. Assicurati di raccogliere tutto il terreno di coltura senza disturbare la popolazione aderente situata sulla superficie di plastica.
- Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 μL/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio PBS utilizzando la linea di aspirazione.
- Sostituire il lavaggio con 130 μL/pozzetto dei seguenti in tre pozzetti ciascuno: PBS, PBS + glucosio, PBS + sali biliari e PBS + sali biliari + glucosio. Questi reagenti devono essere preriscaldati a 37 °C.
- Incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C.
- Rimuovere con cautela la piastra dall'incubatore a 37 °C. Trasferire i surnatanti in una piastra fresca e sterile a 96 pozzetti.
- Utilizzando una piastra da 96 pozzetti o un blocco di diluizione, preparare diluizioni seriali di 10 volte (1:10) del surnatante in PBS sterile.
nota: La serie di diluizioni dovrebbe variare da non diluito a 10-6 a seconda del ceppo batterico da testare. È possibile eseguire esperimenti pilota per determinare l'intervallo di diluizione ottimale.
- Posizionare 5 μl di ciascuna diluizione su agar LB utilizzando una pipetta multicanale. Incubare a 37 °C per una notte. Contare le colonie il giorno successivo e tenere conto del fattore di diluizione nel determinare le unità formanti colonie di recupero (CFU). Per calcolare la percentuale di dispersione relativa al controllo PBS 1x (impostato al 100%), dividere le CFU di recupero di ciascuna condizione di trattamento per le CFU di recupero del campione di controllo PBS 1x.
nota: È possibile utilizzare anche piastre di routine per il ceppo batterico di interesse. Ad esempio, la Shigella può essere placcata su piatti rossi del Congo. Assicurarsi che le piastre siano asciutte per le tecniche di placcatura a punti appropriate.
