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1. Preparazione di un biofilm in vitro di batteri sulla colonia fungina
- Centrifugare la coltura batterica a 5.000 x g per 3 minuti e sospendere il pellet in 25 ml di tampone fosfato di potassio sterile 0,1 M (25 g/L KH2PO4 e 2,78 g/L K2HPO4, pH 5,8). Ripetere questo passaggio una volta e regolare la concentrazione batterica finale a10-9 cellule/ml con lo stesso tampone.
- Riempire una micropiastra a 6 pozzetti con 5 ml di sospensione batterica (o tampone fosfato di potassio sterile 0,1 M per il controllo negativo).
- Tagliare la membrana di cellophane della coltura fungina con una lama di rasoio sterile per ottenere quadrati di cellophane con una singola colonia fungina su ciascuna membrana. Rimuovere con cautela i quadrati di cellophane contenenti ife dal mezzo solido utilizzando una pinza e trasferire il quadrato di cellophane contenente ife in un pozzetto della micropiastra contenente la sospensione batterica.
- Agitare delicatamente la micropiastra mentre le colonie fungine sono ancora attaccate al cellophane; quindi, rimuovere i fogli di cellophane, lasciando le colonie fungine nella piastra.
- Incubare la micropiastra con una leggera agitazione (~60 giri/min) a una temperatura adatta ai microrganismi studiati.
nota: Il tempo di incubazione dipende dalla velocità di insediamento del biofilm e dallo stadio da analizzare. Per P. fluorescens BBc6/L. bicolor, incubare a 20 °C per 30 minuti per ottenere biofilm in fase iniziale e fino a 16 ore per ottenere biofilm maturi.
2. Analisi al microscopio confocale a scansione laser della formazione del biofilm
- Preparazione del campione
- Per rimuovere i batteri planctonici e i batteri attaccati elettrostaticamente alle ife, sciacquare il fungo trasferendolo in una nuova micropiastra a 6 pozzetti riempita con 5 ml di una soluzione salina forte (NaCl, 17 g/L); agitare delicatamente per 1 minuto.
- Trasferire il fungo in una nuova micropiastra a 6 pozzetti contenente 5 ml di tampone fosfato di potassio sterile 0,1 M, agitare delicatamente per 2 minuti e trasferire il fungo in un tampone fosfato di potassio fresco.
- Tagliare la parte della colonia fungina da visualizzare con un bisturi mantenendola nel tampone fosfato di potassio, in modo tale che la sezione ottenuta contenga circa la metà della colonia fungina.
- Per colorare il campione, trasferirlo in una capsula di Petri riempita con acqua sterile contenente un colorante fluorescente appropriato (a seconda dello scopo dell'analisi) e incubarlo al buio.
- Per visualizzare la rete fungina, utilizzare, ad esempio, Congo Red (0,1% di concentrazione finale, 5 minuti di incubazione), lectina agglutina di germe di grano (WGA) coniugata ad Alexa Fluor 633 (10 μg/ml di concentrazione finale, 10 minuti di incubazione) o FUN1 (10 μM di concentrazione finale, 10 minuti di incubazione).
- Se si utilizza un batterio non marcato con fluorescenza, controcolorare le cellule batteriche con una sonda fluorescente specifica per il DNA tra i numerosi coloranti di DNA permeabili alle cellule disponibili in commercio. Ad esempio, utilizzare DAPI (concentrazione finale di 0,25 μg/ml, 10 minuti di incubazione).
- Per visualizzare le proteine della matrice, utilizzare una colorazione proteica.
- Dopo la colorazione, sciacquare il campione trasferendolo in un coperchio di Petri contenente 10 ml di fosfato di potassio sterile 0,1 M e agitare delicatamente per 1 minuto.
- Immergere a metà un vetrino nel coperchio della capsula di Petri e portare delicatamente la sezione tagliata a galleggiare sopra il vetrino. Quindi, rimuovere lentamente il vetrino dalla soluzione tampone, lasciando che il campione si depositi delicatamente sul vetrino.
nota: Per questa fase, è molto importante procedere delicatamente per evitare disturbi del biofilm.
- Infine, aggiungere 10 μl di terreno di montaggio anti-sbiadimento al campione e coprirlo con un vetrino coprioggetti.
nota: Una volta preparato il vetrino, l'analisi microscopica deve essere eseguita il prima possibile (entro un massimo di 30 minuti) per evitare modifiche nella struttura del biofilm.