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1. Immunocolorazione delle cellule T CD8 residenti e delle cellule tumorali
- Diluire gli anticorpi (concentrazione finale 10 μg/mL) e il colorante nucleare (concentrazione finale 1 μg/mL) in terreno RPMI-1640 senza rosso fenolo.
nota: Utilizzare anticorpi anti-CD8 (IgG murine, clone SK1) e anti-EpCAM (molecola di adesione delle cellule epiteliali) (IgG murine HEA-125) accoppiati in fluorescenza per marcare rispettivamente i linfociti T CD8 e le cellule epiteliali tumorali. Utilizzare l'anticorpo anti-CD90/Thy1 (IgG murino, clone 5E10) accoppiato a fluorescenza per marcare i fibroblasti e le cellule endoteliali attivate. Utilizzare il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per marcare il nucleo delle cellule con una membrana plasmatica compromessa al fine di valutare la vitalità tissutale.
- Rimuovere le piastre di coltura dall'incubatore e utilizzare una pipetta per aspirare il liquido all'interno delle rondelle in acciaio inossidabile. Non rimuovere il terreno RPMI-1640 da 1,1 mL posizionato sotto gli inserti per colture cellulari.
- Senza toccare la fetta e utilizzando la punta di una pipetta, aggiungere 40 μl della soluzione contenente gli anticorpi su ciascuna fetta di tumore.
- Incubare la piastra a 37 °C per 15 minuti per consentire la colorazione degli anticorpi.
- Con una pinza fine, rimuovere le rondelle, estrarre le fette e immergerle per 10 secondi in un supporto RPMI-1640 senza rosso fenolo. Riposizionare le fette sugli inserti di coltura cellulare e aggiungere una goccia di terreno RPMI-1640 privo di rosso fenolo su ogni singola fetta. Mantenere la piastra a 37 °C per 10 minuti. Procedi con l'imaging.
2. Imaging e analisi della migrazione delle cellule T CD8 residenti all'interno di fette di tumore polmonare umano
NOTA: Il microscopio confocale utilizzato in questo protocollo è un disco rotante verticale dotato di un obiettivo ad immersione in acqua 25x (25x/0.95 N.A.).
- Preparazione dell'impostazione del microscopio
- Impostare la temperatura della camera termica del microscopio a 37 °C alcune ore prima di iniziare la sessione di imaging.
- Impostare un sistema per perfondere costantemente le fette tumorali con terreno RPMI ossigenato (5% CO2, 95% O2) privo di rosso fenolo (Figura 1). Utilizzare una pompa peristaltica per far fluire il mezzo di perfusione nella camera di imaging e aspirare la soluzione in un pallone di raccolta dei rifiuti.
- Far funzionare la pompa peristaltica per consentire alla soluzione ossigenata di passare attraverso i tubi di perfusione.
- Con una pinza fine, estrarre la fetta dalla piastra a 6 pozzetti e trasferirla nella piastra di plastica da 35 mm riempita con terreno RPMI privo di rosso fenolo. Immobilizzare la fetta con un tassello per fette di diametro 19,7 mm con fili distanziati di 2 mm. Posizionare la piastra di Petri sul tavolino di imaging del microscopio. Collegare le punte di ingresso e uscita del sistema di perfusione. Accendere il sistema di perfusione e impostare la portata del terreno su 0,8 mL/min.
- Abbassare l'obiettivo ad immersione in acqua fino alla fetta. Metti a fuoco la parte superiore della fetta con la luce del campo chiaro. Utilizzando una luce fluorescente appropriata, selezionare una regione di interesse che contenga cellule T CD8, isole tumorali (positive per EpCAM) e un'area dello stroma (positiva per CD90). Verificare la vitalità delle cellule all'interno della fetta valutando la colorazione DAPI sulla superficie di taglio e più in profondità nel tessuto.
NOTA: Una fetta sana contiene solo una minoranza di cellule DAPI-positive a diversi micron dalla superficie tagliata.
- Impostare una sessione di imaging con le seguenti azioni.
- A seconda dell'intensità del segnale fluorescente dei 3 fluorofori, impostare il tempo di esposizione tra 50 e 800 ms e l'intensità del laser tra il 20 e il 40%.
- Selezionare lo spessore della pila z da visualizzare all'interno della fetta del tumore.
nota: Qui sono stati catturati 10-12 piani ottici che coprono una profondità totale di 60-70 μm nella dimensione z.
- Selezionare la posizione iniziale a circa 10 μm sotto le prime cellule T CD8 marcate.
- Definisce l'intervallo di tempo tra ogni immagine z-stack tra 10 e 30 s e il tempo di registrazione totale tra 10 e 30 min.
