NOTA: Questo protocollo enfatizza l'uso della citometria a flusso FRET per rilevare l'attività di semina da campioni biologici di topo. È inoltre compatibile con fibrille ricombinanti e campioni biologici umani. L'eutanasia dei topi e il prelievo di cervelli sono stati eseguiti in conformità con le procedure approvate dall'IACUC.
1. Estrazione del cervello
- Dopo l'anestesia profonda con isoflurano (2%), perfondere un topo con PBS ghiacciato contenente lo 0,03% di eparina ed estrarre il cervello seguendo i dettagli descritti in Gage et al.
- Posizionare il tessuto estratto in una crio-fiala e congelare a scatto inserendolo nell'azoto liquido. In alternativa, congelare il fazzoletto su ghiaccio secco. Una volta congelato, trasferire il tessuto a -80 °C e conservarlo per un periodo di tempo prolungato, se necessario.
nota: Questo protocollo è compatibile con gli omogeneizzati dell'intero cervello o con le regioni cerebrali micro-sezionate. Vedi Hagihara et al.per un protocollo dettagliato di micro-dissezione.
2. Preparazione del materiale biologico per le sementi
- Preparare il tampone di omogeneizzazione sciogliendo gli inibitori della proteasi (senza acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) in 1x TBS (soluzione salina tamponata con Tris, 1 compressa per 10 ml). Agitare energicamente e conservare sul ghiaccio. Gli inibitori della proteasi devono essere privi di EDTA per preservare la vitalità delle cellule del biosensore.
- Pesare il tessuto cerebrale congelato in una navicella monouso e trasferirlo in una provetta conica da 5 ml. Aggiungere un tampone di omogeneizzazione ghiacciato in modo che la soluzione finale sia al 10% in peso/volume. Conservare temporaneamente sul ghiaccio. La massa tissutale e il successivo volume del tampone di omogeneizzazione variano a seconda delle dimensioni del cervello e/o delle regioni utilizzate. Qui, un emicervello di topo adulto del peso di 0,2 g è sospeso in 2 ml per una soluzione al 10% p/vol.
- Trasferire i campioni in una cella frigorifera e regolare un sonicatore a sonda sulle impostazioni appropriate. Per la sonicazione della sonda con un Omni Ruptor (mostrato qui), impostare la potenza al 20%, che corrisponde a circa 75 W. Utilizzare una modalità a impulsi per garantire che i campioni non si surriscaldino durante la sonicazione. Impostare il pulsatore al 30%, corrispondente a circa 500 msec.
- Pulire la punta del sonicatore della sonda risciacquando nuovamente con acqua, isopropanolo e acqua, rimuovendo la sonda tra una soluzione e l'altra. Assicurarsi di risciacquare e pulire entrambi i lati e la parte inferiore della sonda con salviette da laboratorio.
- Lavorando con un campione alla volta, immergere la punta della sonda nel tampone di omogeneizzazione e avviare il sonicatore. Utilizzando le impostazioni di alimentazione e pulsatore descritte sopra, erogare 25 impulsi totali. Assicurarsi che il tessuto sia completamente in sospensione. Fare attenzione a evitare la formazione di schiuma sul campione durante questa fase.
nota: I campioni sono suscettibili alla formazione di schiuma se a) il volume totale è basso o b) l'omogenato si riscalda. Con questo specifico strumento, non sonicare con volumi inferiori a 250 μl. Per garantire che i campioni rimangano refrigerati, le provette possono essere conservate in ghiaccio durante questa fase.
- Pulire la sonda rimuovendo il lisato residuo, quindi erogare 10 impulsi in un becher di acqua pulita. Sciacquare i lati e il fondo della sonda con acqua, isopropanolo e di nuovo acqua (come al punto 2.4), asciugando asciugando tra un passaggio e l'altro. Per evitare contaminazioni, sciacquare accuratamente la sonda tra un campione e l'altro.
nota: Con gli aggregati tau, non abbiamo riscontrato che siano necessari metodi di pulizia più rigorosi per prevenire la contaminazione da campione a campione. Altre amiloidi, tuttavia, possono richiedere cure aggiuntive, che sono state ampiamente descritte in letteratura.
- Conservare gli omogeneizzati su ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati.
- Omogeneizza in centrifuga a 21.300 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in un tubo pulito, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Scartare il pellet. Aliquotare il surnatante e conservare i lisati a -80 °C per un ulteriore utilizzo. Evitare i cicli di congelamento/scongelamento degli omogeneizzati, tuttavia, poiché ciò riduce l'efficienza della semina.
3. Riplaccatura delle celle biosensore
NOTA: Utilizzare quattro linee cellulari per questo test: HEK 293T (linea cellulare #1), RD-P301S-CFP (linea cellulare #2), RD-P301S-YFP (linea cellulare #3) e RD-P301S-CFP/YFP (linea cellulare #4). Si prega di consultare la Tabella di riferimento 1 per il contributo di ciascuna linea cellulare al saggio.
- In un ambiente sterile, aspirare il terreno di coltura. Sciacquare le celle con soluzione salina calda tamponata con fosfato (PBS) e aspirare. Tripsinizzare le cellule (3 ml di tripsina-EDTA (0,05%)) per 3 minuti, estinguere con terreno di coltura caldo (9 ml di DMEM, 10% siero fetale bovino (FBS), 1% penicillina/streptomicina, 1% GlutaMax) e trasferire immediatamente le cellule in una provetta conica.
- Centrifugare le celle a 1.000 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura caldo.
- Utilizzando un emocitometro, determinare la densità cellulare per ciascuna linea cellulare. La densità cellulare varierà a seconda della confluenza al momento del prelievo e del volume di risospensione. Risospendere le cellule raccolte da una piastra di 10 cm alla confluenza del 90% in un terreno da 10 ml, per ottenere una densità cellulare di circa 1 milione di cellule/ml.
- Realizzare una miscela master di celle + terreni in modo tale che ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenga 35.000 cellule in terreni da 130 μl (ad esempio, per creare una miscela master per 100 pozzetti, risospendere 3,5 milioni di cellule in terreni da 13 ml). Modifica il numero di cella per adattarlo ai singoli disegni sperimentali e alle linee temporali. Per il trattamento cellulare ~18 ore dopo la piastra, aggiungere 35.000 cellule a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Utilizzando una pipetta multicanale, pipettare lentamente 130 μl di sospensione di cellule master mix in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto trattata con coltura tissutale. Durante la piastratura, posizionare la punta della pipetta al centro del pozzetto, senza toccare il fondo della piastra.
nota: Sebbene il formato della placcatura possa essere modificato, si consiglia di fare n = 4 pozzetti per ciascuna delle linee cellulari 1-3 per piastra. Il resto della piastra (n = 84) è riservato alla linea cellulare #4 (celle biosensore).
- Lasciare che le cellule si depositino lasciando la piastra indisturbata per 10 minuti a RT. Incubare O/N a 37 °C, 5% CO2 e ≥80% di umidità relativa.
4. Trattamento delle cellule
NOTA: Il giorno seguente, quando le cellule del biosensore tau sono confluenti al 60-65%, prepara i complessi di trasduzione del seme come segue:
- In una provetta, combinare il reagente di trasfezione, come la lipofectamina, con terreni a siero ridotto, come Opti-MEM, per ottenere una miscela master. Per ogni pozzetto, aggiungere 1,25 μl di reagente di trasfezione e 8,75 μl di terreno sierologico ridotto. Muovere delicatamente il tubo per mescolare, girare brevemente verso il basso e incubare per 5 minuti a RT.
- In un'altra provetta, combinare il materiale del seme (aliquota di lisato del passaggio 2.9) con il terreno a siero ridotto.
nota: Il volume del materiale del seme varierà a seconda dell'esperimento individuale. Quando si sceglie il volume del seme, prendere in considerazione: l'abbondanza di semi in un campione e la potenziale tossicità. Gli omogeneizzati grezzi possono essere tossici per le cellule. Pertanto, utilizza il volume più basso possibile per monitorare l'effetto desiderato. I volumi precedentemente testati di lisato/pozzetto vanno da 1 a 5 μl, corrispondenti a 5-20 μg di proteine totali. Assicurarsi che il volume totale per pozzetto (semi + terreno di coltura sierologico ridotto) sia di 10 μl.
- Combinare il contenuto delle due provette descritte nei punti 4.1 e 4.2, agitare delicatamente per mescolare, centrifugare brevemente verso il basso (1.000 x g, 5 sec) e incubare a RT per almeno 20 minuti e fino a 2 ore.
- Pipettare delicatamente 20 μl di complesso di trasduzione sul lato dei singoli pozzetti del biosensore. Se possibile, utilizzare tre repliche tecniche. Riportare le cellule trattate nell'incubatore per 24-48 ore. Incubare nelle stesse condizioni descritte al punto 3.6.
nota: La condizione di controllo negativo appropriata per questa configurazione sono le cellule biosensore trattate con liposomi vuoti (ad esempio, reagente liposomico + terreno sierologico ridotto) perché l'applicazione di fosfolipidi introduce un leggero cambiamento nel profilo di fluorescenza rispetto alle cellule biosensore non esposte al reagente liposomiale.
5. Raccolta di cellule per la citometria a flusso FRET
NOTA: Prima di prelevare le cellule, generalmente 24-48 ore dopo il trattamento, è possibile ottenere una lettura preliminare dell'attività di semina utilizzando il filtro per proteine fluorescenti verdi (GFP) su un microscopio a fluorescenza invertito standard. Le cellule trattate senza materiale di semina (cioè liposomi vuoti) mostreranno una fluorescenza diffusa, mentre le cellule trattate con materiale di semi mostreranno intense inclusioni intracellulari punteggiate e reticolari (Figura 1A-B).
- Utilizzando una pipetta multicanale, aspirare tutto il terreno cellulare (150 μl) . Tripsinizzare le cellule (50 μl) per 5 minuti e raffreddarle con 150 μl di terreno di coltura refrigerato. Non includere un risciacquo PBS prima della tripsinizzazione in questa fase, poiché potrebbe causare il sollevamento delle cellule e la successiva perdita di cellule. Escludere eventuali cellule morte e detriti contaminanti durante la citometria a flusso tramite strategie di gating.
- Subito dopo la tempra, trasferire le celle su una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a RT.
- Aspirare e scartare il fluido, facendo attenzione a non disturbare il pellet della cella.
- Delicatamente, ma accuratamente, risospendere il pellet cellulare in 50 μl di paraformaldeide al 2% e incubare per 10 minuti. In alternativa, far funzionare le cellule vive, anche se la fissazione fornisce risultati più puliti e coerenti.
- Centrifugare le celle a 1.000 x g per 5 minuti a RT. Aspirare e scartare la paraformaldeide, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare.
- Delicatamente, ma accuratamente, risospendere il pellet cellulare in 200 μl di tampone per citometria a flusso refrigerato (Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 1% FBS, 1 mM EDTA) ed eseguire la piastra il prima possibile per evitare la formazione di grumi cellulari.
6. Citometria a flusso FRET
NOTA: Utilizzare un citometro a flusso come il MACSQuant VYB, che è dotato di linee laser compatibili con FRET e set di filtri (Tabella 2). Per ogni passaggio all'interno di questa sezione, fare clic sul pozzetto di interesse utilizzando il modello a 96 pozzetti del software e fare clic su "riproduci" per iniziare l'assorbimento e il flusso del campione. Crea grafici o tabelle statistiche facendo clic sull'icona "nuova finestra di analisi". Modificare i parametri dell'asse sui singoli grafici bivariati facendo clic sul titolo sull'asse X o Y e selezionando il filtro appropriato. Per spostare le popolazioni cellulari o i segnali di fluorescenza, aumentare o diminuire le tensioni associate ai filtri appropriati. Con questo strumento, è possibile eseguire <1.000 eventi/sec per garantire un monitoraggio accurato di singole cellule.
- Realizzare un grafico bivariato Side Scatter-Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) e, con la linea cellulare #1 in esecuzione, regolare le tensioni SSC e FSC fino a quando la popolazione cellulare non si trova nel quadrante inferiore sinistro. Fare clic sullo strumento poligono e definire la popolazione di celle (Gate P1). Per tutti i parametri di iniezione vedere la Figura 2.
- Crea un grafico bivariato FSC-H (altezza) vs FSC-A e applica il Gate P1 a questo grafico facendo clic su "live" sopra il grafico e selezionando P1. Con la linea di cella #1 in esecuzione, fare clic sullo strumento poligono e definire le singole celle (Gate P2).
- Crea 3 grafici a istogramma, uno per ciascuno dei filtri di interesse: CFP, YFP e FRET. Applica il Gate P2 a tutti questi lotti facendo clic su "live" sopra i lotti e selezionando P2. Con la linea cellulare #1 in funzione, regolare le tensioni in modo tale che la popolazione cellulare mediana negli istogrammi CFP, YFP e FRET sia compresa tra 0 e 1. Per misurare CFP e FRET, eccitare le celle con il laser a 405 nm e catturare la fluorescenza con un filtro a 450/50 nm e 525/50 nm, rispettivamente. Per misurare l'YFP, eccitare le cellule con un laser a 488 nm e catturare la fluorescenza con un filtro da 525/50 nm. Le impostazioni del laser e del filtro sono ulteriormente descritte nella Tabella 2.
- Eseguire la compensazione per lo spillover della CFP nei canali FRET e YFP.
nota: La compensazione è il processo di correzione dello spillover della fluorescenza. Lo spillover della fluorescenza si verifica ogni volta che l'emissione di fluorescenza di un fluorocromo viene rilevata all'interno di un filtro progettato per misurare il segnale proveniente da un altro fluorocromo. Con un'adeguata compensazione, la fluorescenza di spillover CFP può essere rimossa dai canali FRET e YFP.
nota: La compensazione richiede la presenza di cellule fluorescenti positive e negative. Pertanto, per compensare le cellule CFP-positive (linea cellulare #2), le cellule negative (linea cellulare #1) devono essere aggiunte al campione prima della corsa.
- Picco in 30 μl di sospensione della linea cellulare #1 da un singolo pozzetto in 200 μl di sospensione della linea cellulare #2 immediatamente prima della compensazione.
- Fare clic sull'icona "Impostazioni strumento", quindi sulla scheda "compensazione" e selezionare "matrice" per aprire la tabella di compensazione.
- Effettuare un grafico bivariato FRET-A vs CFP-A e applicare il gate P2, come descritto nel passaggio 6.3. Con le linee cellulari 1+2 in esecuzione, fare clic sull'icona "quadrante" e disegnare i quadranti in modo che le popolazioni fluorescenti negative e positive siano separate dai due quadranti inferiori (Gates LL3 e LR3, rispettivamente).
- Creare una tabella statistica che mostri l'intensità di fluorescenza mediana (MFI) di FRET per i gate LL3 e LR3. Regolare il parametro FRET nella matrice di compensazione fino a quando l'MFI del segnale FRET è equivalente tra LL3 e LR3. Seguendo questo passaggio, l'MFI del segnale FRET è uguale tra le cellule non colorate e le cellule CFP-positive, suggerendo l'assenza di spillover di CFP nel canale FRET.
- Tracciare un grafico bivariato YFP-A vs CFP-A e applicare il gate P2, come descritto nel passaggio 6.3. Disegna quadranti (LL4 e LR4) in modo simile a quello fatto nel passaggio 6.4.3.
- Creare una tabella statistica che visualizzi l'MFI di YFP per LL4 e LR4. Regolare il parametro YFP nella matrice di compensazione fino a quando l'MFI del segnale YFP è equivalente tra LL4 e LR4. Seguendo questo passaggio, l'MFI di un segnale YFP è uguale tra le cellule non colorate e le cellule CFP-positive, suggerendo l'assenza di spillover di CFP nel canale YFP.
- Dopo l'impostazione e la compensazione del cancello, evidenziare i pozzetti di interesse ed eseguire il resto della piastra.
- Dopo che tutti gli esempi sono stati eseguiti, esportare i file di dati facendo clic su "file", quindi su "copia". Seleziona la scheda "file di dati", evidenzia la cartella dell'esperimento e fai clic su "copia".
