Una tecnica per valutare l'effetto inibitorio dell'esposizione alla tossina sulle correnti postsinaptiche eccitatorie in miniatura (mEPSC)

Abstract

Fonte: Hubbard, K. et. al., Valutazione funzionale delle neurotossine biologiche in colture in rete di neuroni del sistema nervoso centrale derivati da cellule staminali.J. Vis. Exp. (2015)

Il video dimostra l'analisi elettrofisiologica dei neuroni derivati da cellule staminali embrionali dopo l'esposizione alle neurotossine. Il trattamento di questi neuroni con neurotossine botuliniche riduce la frequenza delle correnti post-sinaptiche eccitatorie spontanee in miniatura, confermando l'inibizione della trasmissione sinaptica.

Protocollo

1. Adattamento delle cellule staminali embrionali (ESC) alla coltura in sospensione senza cellule alimentatrici

1. Scongelare le ESC a 37 °C fino a quando rimane una scheggia di ghiaccio.
2. Utilizzando una pipetta P1000, trasferire delicatamente 1 - 2,5 x 10⁶ ESC dissociate in una piastra non trattata con coltura tissutale contenente 10 ml di terreno ESC preriscaldato. Incubare in un incubatore di coltura tissutale umidificato per 20 ore a 37 °C e 5% di anidride carbonica (CO_{2 ).}
3. Dopo 20 ore, lavare le cellule trasferendo delicatamente la coltura in sospensione in una provetta conica da 15 ml utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Pellet ESC per 3 min a 200 x g. Durante la centrifuga, aggiungere 10 ml di piatto ESC fresco a media o bassa aderenza.
4. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non spostare il pellet cellulare, e aggiungere 1 ml di terreno ESC fresco al pellet cellulare. Trasferire le cellule nella capsula batterica utilizzando una pipetta P1000 e rimetterle nell'incubatore.
5. Osservare le cellule ogni giorno fino a quando gli aggregati diventano visibili ad occhio nudo (in genere 4 - 8 giorni (d); gli aggregati saranno di 0,2 - 0,5 mm). Se gli aggregati non sono evidenti dopo 4 giorni, ripetere il passaggio 1.3. Una volta che gli aggregati sono visibili, dissociare e mantenere gli ESC come descritto nella Sezione 2.

2. Passaggio e manutenzione ESC

1. Trasferire gli aggregati ESC in una provetta conica da 15 ml utilizzando una pipetta sterile da 10 ml e lasciare che gli aggregati si depositino in un pellet compatto (in genere 3 - 5 minuti). Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non rompere il pellet cellulare, e lavare gli aggregati con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Sebbene la sedimentazione per gravità sia consigliata, in alternativa, le celle a pellet a 100 x g per 2,5 minuti invece di risparmiare tempo.
2. Aspirare il PBS e aggiungere 500 μl di tripsina. Incubare gli aggregati in tripsina per 3 minuti a bagnomaria a 37 °C. Aggiungere 500 μl di terreno ESC per diluire la tripsina e triturare delicatamente 10 volte con una pipetta P1000 per rompere gli aggregati. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
3. Pellettare le cellule dissociate per 3 minuti a 200 x g e risospendere le cellule fino a una concentrazione finale di 1,0 x 10⁷ cellule/ml in terreno ESC. Trasferire 150 μl (1,5 x 10⁶ cellule) in 10 ml di terreno ESC fresco in una piastra batterica di 10 cm e rimetterlo nell'incubatore di coltura tissutale per 48 ore. Le ESC in eccesso possono essere differenziate, crioconservate a 1 - 5 x 10⁶ cellule/ml in terreno ESC al 90% integrato con dimetilsolfossido (DMSO) al 10% o scartate.
4. Gli aggregati di passaggio saranno ben visibili. Gli aggregati pronti per il passaggio saranno ben visibili, con diametri superiori a 0,5 mm.
   nota: Lo scongelamento e la coltura di cellule crioconservate e adattate alla sospensione vengono eseguite secondo i passaggi 1.2 - 1.4. Gli aggregati saranno pronti per il passaggio entro 48 - 72 ore.

3. Differenziazione neuronale

NOTA: Esegui i passaggi 3.1 - 3.5 prima di mezzogiorno e il passaggio 3.7 dopo mezzogiorno. Una panoramica delle procedure di differenziazione è presentata nella Figura 1A.

1. Dissociare gli ESC come nei passaggi 2.1 - 2.5. Trasferire 350 μl (3,5 x 10⁶) di ESC dissociate in una piastra a bassa aderenza di 10 cm contenente 25 ml di terreno di differenziazione. Posizionare su un agitatore orbitale impostato a 30 - 45 giri/min all'interno di un incubatore per colture tissutali a 37 °C con il 5% di CO₂. Questo è il primo giorno di differenziazione, denominato giorno in vitro (DIV) -8,
   nota: L'utilizzo di una piastra con attacco ultra-basso aumenta il costo del metodo, ma produce rese leggermente maggiori rispetto alle piastre di Petri batteriche, poiché gli aggregati possono occasionalmente aderire alle piastre di Petri. I volumi medi e il numero di celle possono essere scalati di conseguenza se si preferiscono piatti di dimensioni diverse.
2. Dopo 48 ore (DIV -6), utilizzare una pipetta da 25 ml per trasferire gli aggregati cellulari differenzianti in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere immediatamente 25 ml freschi di terreno di differenziazione alla piastra di Petri.
3. Lasciare sedimentare gli aggregati per 2 - 5 minuti, producendo un pellet visibile profondo 1 - 2 mm. Ignora le singole celle o i piccoli aggregati rimasti in sospensione. Aspirare con cura il terreno e trasferire nuovamente il pellet di cella nella capsula di Petri utilizzando un P1000. Posizionare sull'agitatore rotante in un incubatore per colture tissutali.
4. A DIV -4, ripetere il passaggio 3.2. Il pellet avrà una profondità di 2 - 4 mm. Sostituire 30 ml di terreno di differenziazione integrato con 6 μM di acido retinoico (RA) all-trans nella capsula di Petri. Rimettere all'agitatore rotante nell'incubatore per colture tissutali per altre 48 ore.
5. A DIV -2, ripetere il passaggio 3.3. A questo punto il pellet avrà una profondità di 4 - 8 mm.
6. Alla DIV -1, preparare le superfici di placcatura come nella Sezione 4.
7. A DIV 0, scongelare 5 ml di terreno di tripsinizzazione di cellule progenitrici neurali (NPC) pre-aliquotate e congelate a 37 °C per 5 - 10 minuti e metterli in una cappa di coltura tissutale. Utilizzando una pipetta da 25 ml, trasferire gli aggregati differenzianti in una provetta conica da 50 ml. Lasciare depositare gli aggregati e aspirare con cura il substrato. Lavare il pellet due volte con 10 ml di PBS, lasciando che gli aggregati si depositino tra un lavaggio e l'altro.
8. Dopo il secondo lavaggio PBS, aggiungere 5 ml di terreno di tripsinizzazione NPC al pellet e incubare a 37 °C per 5 minuti. Muovere delicatamente la provetta dopo 2,5 minuti.
9. Aggiungere 5 ml di inibitore della tripsina di soia allo 0,1% (IST) per inattivare la tripsina e mescolare invertendo. Triturare delicatamente 10 - 15 volte con una pipetta sierologica da 10 ml fino a produrre una sospensione cellulare relativamente omogenea.
10. Trasferire lentamente la sospensione cellulare in un filtro cellulare da 40 μm o 70 μm posizionato sulla parte superiore di una provetta conica da 50 ml. Una volta che tutta la sospensione è stata filtrata, aggiungere 1 ml di terreno N2 per lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro e pellettare la sospensione cellulare dissociata per 6 minuti a 200 x g.
11. Aspirare il fluido senza disturbare il pellet. Lavare le celle due volte con 10 ml di terreno N2, le celle a pellet per 5 minuti a 200 x g e triturare tra un lavaggio e l'altro con un P1000. Prima del secondo lavaggio, contare le cellule utilizzando un emocitometro.
12. Risospendere le cellule in terreno N2 a 1 x 10⁷ cellule per ml e piastrarle i neuroni derivati da cellule staminali embrionali (ESN) a una densità cellulare di 150.000 - 200.000 cellule/cm².
13. Trasferire gli ESN appena piastrati in un incubatore di coltura tissutale umidificato a 37 °C e 5% di CO₂ e mantenere come indicato nella Sezione 5.

4. Preparazione delle superfici di coltura per la placcatura dei precursori neurali a DIV 0

1. Preparare i piatti trattati con coltura tissutale almeno 1 giorno prima della piastratura. Aggiungere una quantità sufficiente di polietilenimmina (PEI; 25 μg/ml in H₂O sterile) o poli-D-lisina (PDL; 100 μg/ml in H₂O sterile) per coprire le piastre di plastica trattate con coltura tissutale e incubare O/N a 37 °C.
2. La mattina dell'impiattamento, lavare le stoviglie due volte con H₂O a doppia distillazione e una volta con PBS. Dopo il lavaggio finale, aggiungere una quantità sufficiente di terreno N2 per coprire la piastra (ad esempio, 1 ml per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti o 4 ml per piastra da 6 cm).
3. Preparare vetrini coprioggetti in vetro da 18 mm almeno un giorno prima della placcatura dei neuroni. Pulire i vetrini coprioggetti mediante pulizia al plasma per 4 min.
4. Trasferire immediatamente i vetrini coprioggetti puliti su un parafilm lavato con etanolo sul fondo di un grande piatto sterile e aggiungere 400 μl di soluzione PEI o PDL, preparata come al punto 4.1. Incubare per una notte (O/N) a 37 °C in un incubatore per colture tissutali.
5. Al mattino, lavare tre volte i vetrini coprioggetti con acqua e aggiungere 5 μg/ml di laminina in PBS per 1 - 3 ore a 37 °C. Prima di dissociare i neuroni, aspirare la laminina e trasferire immediatamente il vetrino coprioggetti in un pozzetto di una capsula a 12 pozzetti contenente 1 ml di terreno NPC, assicurandosi di mantenere il lato trattato rivolto verso l'alto.
6. Conservare le stoviglie e i vetrini coprioggetti a 37 °C fino a quando gli NPC non sono pronti per l'impiattamento.

5. Manutenzione dei neuroni

1. Al DIV 1, aspirare il terreno e sostituirlo con il terreno di coltura N2.
2. Ai punti DIV 2 e 4, aspirare il terreno e sostituirlo con il terreno di coltura B27.
3. Al DIV 8, aspirare il terreno e sostituirlo con un terreno di coltura B27 contenente inibitori mitotici per eliminare le cellule non neuronali contaminanti.
4. Al DIV 12, sostituire con terreno di coltura B27.
5. Non rimuovere gli ESN DIV 12⁺ dal 5% di CO₂ fino al momento del prontismo.

6. Saggio di inibizione misurata della trasmissione sinaptica (MIST) per quantificare le correnti post-sinaptiche eccitatorie in miniatura

ATTENZIONE: Le neurotossine clostridiali sono le sostanze più velenose conosciute, con valori stimati di LD₅₀ nell'uomo a partire da 0,1 - 1 ng/kg. Ottenere le approvazioni necessarie prima di utilizzare queste tossine e utilizzare le precauzioni appropriate.

1. Diluire accuratamente BoNT/A a 100x, la concentrazione finale desiderata nel terreno di coltura ESN, e scaldare a 37 ºC. Aggiungere il volume appropriato di tossina alle colture ESN DIV 21+, agitare il piatto di coltura e rimetterlo nell'incubatore.
2. Se le cellule verranno analizzate più di 4 ore dopo l'intossicazione, aggiungere una tossina al piatto e agitare senza rimuovere dal 5% di CO₂, ad esempio direttamente nell'incubatore o in una camera a CO₂ costante.
3. Al momento opportuno, aspirare il terreno di coltura ESN e lavare due volte con un tampone di registrazione extracellulare (ERB). Aggiungere 4 ml di ERB integrato con 5,0 μM di tetrodotossina e 10 μM di bicucullina, bloccando i potenziali d'azione e antagonizzando l'attività del recettore GABA_A, rispettivamente.
4. Trasferire la capsula nell'impianto di elettrofisiologia. Per il test MIST non sono necessari né perfusione né controllo della temperatura.
5. Estrarre il vetro borosilicato utilizzando un estrattore per micropipette per produrre una pipetta di registrazione con resistenza di 5-10 mΩ e riempirla con un tampone di registrazione intracellulare. Immergere delicatamente la pipetta di registrazione riempita nel reagente siliconizzante prima della registrazione.
6. Utilizzando una siringa riempita d'aria, fornire una pressione positiva mentre la pipetta di registrazione viene abbassata nell'ERB. Dopo aver fatto atterrare delicatamente la pipetta di registrazione sul soma del neurone da registrare, rimuovere la pressione positiva e formare un gigaseal. Diminuire la tensione di mantenimento a -70 mV. Applicare con cautela una pressione negativa per entrare nella configurazione a cella intera.
7. Passa alla pinza amperometrica per monitorare e registrare il potenziale della membrana a riposo. Senza regolazione per i potenziali di giunzione liquida, il potenziale di membrana a riposo sarà compreso tra -67 e -82 mV.
8. Eseguire una registrazione continua del voltage-clamp a -70 mV per 4 - 5 minuti per rilevare le correnti post-sinaptiche eccitatorie in miniatura (mEPSC).
9. Analizza 4 minuti di dati registrati per il rilevamento mEPSC utilizzando il software di rilevamento dei picchi con le seguenti impostazioni: Soglia, 5; Periodo per la ricerca di un massimo locale, 10.000 μsec; Tempo prima di un picco per il basale, 5.000 μsec; Periodo di ricerca di un tempo di decadimento, 20.000 μsec; Frazione del picco per trovare un tempo di decadimento, 0,37; Periodo per calcolare la media di una linea di base, 1.000 μsec; Soglia di superficie, 20; Numero di punti per il picco medio, 1; Direzione del picco, negativa.
10. Raccogli e salva informazioni sugli eventi rilevati. Dividi il numero di eventi rilevati in 4 minuti per 240 per determinare la frequenza mEPSC in Hz.
11. Raccogli le frequenze mEPSC per 8-12 controlli e 8-12 campioni trattati con BoNT per ogni condizione di esposizione. Analizza la frequenza rispetto ai controlli abbinati per età e lotto. Determinare la significatività statistica della percentuale di inibizione dell'attività sinaptica utilizzando l'ANOVA unidirezionale e il test post-hoc di Dunnett.

Risultati

Figura 1. Gli ESN adattati alla sospensione rimangono mitoticamente stabili ed esprimono marcatori di pluripotenza.(A) Schema della manutenzione e differenziazione dell'ESC. La presenza o l'assenza di acido retinoico (RA) o fattore inibitorio della leucemia (LIF) è contrassegnata da un + o –. Viene fornito un confronto tra i giorni in vitro (DIV) e gli stadi di sviluppo clas...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tabella 1. ESC e ESN
Knockout DMEM	Tecnologie per la vita	Codice 10829-018	Terreno: Terreno di coltura ESC
			Formulazione e note: 500 mL
100x MEM NEAA	Tecnologie per la vita	Codice 11140-050	Fluidi: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese
			Formulazione e note: 6 mL
200 mM di L-Alanil-L-Glutammina	ATCC	30-2115	6 ml
FBS qualificato ES	Cellule staminali applicate	ASM-5007	90 ml
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	3 ml
55 mM di 2-mercaptoetanolo	Tecnologie per la vita	Codice: 21985-023	1,1 ml
107 Unità/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μl
Knockout DMEM	Tecnologie per la vita	Codice 10829-018	Fluidi: Mezzo di differenziazione ESC
			Formulazione e note: 436,6 mL
100x MEM NEAA	Tecnologie per la vita	Codice 11140-050	Fluidi: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese
			Formulazione e note: 5 mL
200 mM di L-Alanil-L-Glutammina	ATCC	30-2115	5 ml
Siero qualificato ESC	Cellule staminali applicate	ASM-5007	50 ml
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	2,5 ml
55 mM di 2-mercaptoetanolo	Tecnologie per la vita	Codice: 21985-023	0,9 ml
La PBS di Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Terreno: Terreno di tripsinizzazione NPC
			Formulazione e note: 100 mL
0,5 milioni di EDTA (18,3%)	Sigma-Aldrich	3690	Terreno: congelare in 5 mL aliquote
			Formulazione e note: 0,266 mL
tripsina	Sigma-Aldrich	Codice: T8802	50 mg
Polietilenimmina (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Media: Soluzioni di rivestimento superficiale
			Formulazione e note: 2,5 μg/mL in H20
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280	Supporti: utilizzare entro 1 settimana
			Formulazione e note: 100 μg/mL in H20
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/mL in H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Tecnologie per la vita	Codice 10565-018	Terreno: Terreno di coltura NPC
			Formulazione e note: 492,5 mL
100x vitamine N2	Tecnologie per la vita	Codice 17502-048	Fluidi: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese
			Formulazione e note: 5 mL
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	2,5 ml
Neurobasale A	Tecnologie per la vita	Codice 10888-022	Terreni: Terreno di coltura ESN
			Formulazione e note: 482,5 mL
50x vitamine B27	Tecnologie per la vita	Codice 17504-044	Fluidi: conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese
			Formulazione e note: 10 mL
200 mM di L-Alanil-L-Glutammina	ATCC	30-2115	5 ml
100x antibiotici	Sigma-Aldrich	Codice: A5955	2,5 ml
5-fluoro-2'-deossiuridina (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Terreno: 2000x inibitori mitotici aliquotare e conservare a -20 °C
			Formulazione e note: dd 150 mg 5FDU e 350 mg di uridina a 10 mL Neurobasal A. Filtro sterile, aliquotare e congelare. Utilizzare 2000x nel terreno di coltura ESN.
uridina	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express Tripsina	Tecnologie per la vita	Codice 12605-010	Media: Varie
			Formulazione e note: conservare presso RT
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	negozio presso RT
Inibitore della tripsina della soia (IST)	Sigma-Aldrich	T6414	conservare a -20 °C
etanolo	Sigma-Aldrich	E7023	negozio presso RT
acido ascorbico	Sigma-Aldrich	Codice: A4403	Preparare 100 mM di brodo sciogliendo 100 mg di acido ascorbico in 5,7 mL di miscela 50:50 DMSO/etanolo.
Acido retinoico (RA)	Sigma-Aldrich	Codice: R2625	Risospendere 15 mg di AR in 9 mL di DMSO/etanolo 50:50. Integrare con 1 mL di brodo di acido ascorbico 100 mM. Aliquotare e conservare a -80 °C. Stabile per 6 mesi.
Tabella 2. Nebbia
NaCl	Sigma-Aldrich	Codice: 71386	Media: Buffer di registrazione extracellulare
			Concentrazione finale (mM): 58,44
			MW: 140
Kcl	Sigma-Aldrich	Codice 60135	Fluidi: (ERB; pH = 7,3, 315 mO)
			Concentrazione finale (mM): 74,56
			MW: 3,5
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	Episodio 3139	Fluido: Stabile a 4 °C per almeno 6 mesi.
			Concentrazione finale (mM): 119,98
			MW: 1,25
CaCl2	Sigma-Aldrich	Codice 21115	Concentrazione finale (mM): 110,98
			MW: 2
MgCl2	Sigma-Aldrich	Codice 63069	Concentrazione finale (mM): 95,21
			MW: 1
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G8644	Concentrazione finale (mM): 180,16
			MW: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Concentrazione finale (mM): 238,3
			MW: 10
K-gluconato	Sigma-Aldrich	P1847	Media: Buffer di registrazione intracellulare
			Concentrazione finale (mM): 234,5
			MW: 140
NaCl	Sigma-Aldrich	Codice: 71386	Fluidi: (IRB; pH = 7,3, 320 mO)
			Concentrazione finale (mM): 58,44
			MW: 5
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale A9187	Fluido: Stabile a 4 °C per almeno 6 mesi.
			Concentrazione finale (mM): 507,18
			MW: 2
Li-GTP	Sigma-Aldrich	G5884	Concentrazione finale (mM): 523,18
			MW: 0,5
CaCl2	Sigma-Aldrich	Codice 21115	Fluido: Stabile a 4 °C per almeno 6 mesi.
			Concentrazione finale (mM): 110,98
			MW: 0,1
MgCl2	Sigma-Aldrich	Codice 63069	Fluido: Stabile a 4 °C per almeno 6 mesi.
			Concentrazione finale (mM): 95,21
			MW: 1
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	380.35 Fluido: Stabile a 4 °C per almeno 6 < br /> Concentrazione finale (mM): 380,35 MW: 1
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Fluido: Stabile a 4 °C per almeno 6 mesi.
			Concentrazione finale (mM): 238,3
			MW: 10
Bicucullina	Tocris	131	Media: Varie
			Concentrazione finale (mM): 0,01
			MW: 417,85
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Concentrazione finale (mM): 0,01
			MW: 276,12
Tetrodotossina	Sigma-Aldrich	A8001	Concentrazione finale (mM): 0,005
			MW: 645,74
BoNT/A-/G	Metabiologici	N/A	media:
			Concentrazione finale (mM): TBD
			MW: 150.000
Tossina tetanica	Sigma-Aldrich	T3194	Concentrazione finale (mM): TBD
			MW: 150.000
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2	Concentrazione finale (mM): N/A
			MW: N/A
Tabella 3. Attrezzature e software
MiniAnalysis (versione 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	N/A	Software di rilevamento eventi
Igor Pro (versione 6.22A)	WaveMetrics	N/A	Software per la visualizzazione delle registrazioni
Patchmaster	Heka	N/A	Software di acquisizione dati
Microscopio invertito Olympus IX51	Olimpo	N/A
Micromanipolatore	Strumento Sutter	Pannello MPC-365
Amplificatore patch-clamp	Heka	ECB10USB
Estrattore per micropipette	Strumento Sutter	P-1000
Tubi capillari in borosilicato	Strumento Sutter	B150-86-10	Corning 7740
vetrini coprioggetti in vetro da 18 mm	pescatore	12-545-84
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Filtro cellulare (40 μm)	pescatore	08-771-1
Stovall Danzatrice del ventre shaker	pescatore	Codice 15-453-211
Piatti a bassa adesione	pescatore	05-539-101	Corning 3262
Piatti batterici	VWR	Codice 25384-302	100 x 15 millimetri