Produzione di anticorpi da una coltura di crescita eccessiva in batch di cellule di mammifero trasfettate

Abstract

Fonte: Elgundi, Z. et al., Produzione e purificazione su scala di laboratorio di un anticorpo terapeutico.J. Vis. Exp.(2017)

Il video dimostra un metodo per produrre anticorpi terapeutici utilizzando cellule di mammifero trasfettate stabilmente. L'integrazione di triptone stimola la divisione cellulare, con conseguente crescita eccessiva e sostenendo una maggiore resa anticorpale. Il terreno contenente anticorpi viene raccolto, filtrato e conservato per un ulteriore utilizzo.

Protocollo

NOTA: Per questo protocollo deve essere utilizzato un vettore di espressione di mammifero adatto. In questo caso, viene utilizzato un singolo costrutto contenente due cassette di espressione (ad esempio, l'espressione della catena pesante e leggera è guidata da promotori separati). Le catene pesanti e leggere di trastuzumab sono state precedentemente clonate nel vettore. Questo vettore è stato un dono di Andrew Beavil, ottenuto attraverso un deposito di plasmidi senza scopo di lucro.

1. Recupero e scale-up del DNA vettoriale

NOTA: Il DNA vettoriale è stato ricevuto come coltura di agar morbido nel ceppo Escherichia coli XL-1 Blue; il vettore trasporta resistenza all'igromicina.

1. Inserire una pugnalata o un'ansa di inoculazione sterile nell'agar morbido della coltura di pugnalata, quindi striare una piastra di agar Luria Bertani (LB) preparata con 75 μg/ml di igromicina per colonie isolate. Incubare la piastra a 37 °C per 18-24 ore.
2. Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo Terrific (TB) contenente 75 μg/ml di igromicina. Incubare la coltura a 37 °C per 18-24 ore agitando a 225 giri/min.
3. Utilizzare la coltura notturna per preparare uno stock di glicerolo di DNA vettore mescolando delicatamente 800 μl di coltura con 200 μl di glicerolo all'80% in un crioviale e congelare a -80 °C.
   1. Aggiungere 100 μl della coltura notturna a 100 ml di TB contenenti 75 μg/ml di igromicina in un pallone agitatore con deflettore (cioè 1/1.000 di diluizione). Incubare la coltura a 37 °C per 18-24 ore con agitazione a 225 giri/min.
4. Dopo la coltura notturna, estrarre e purificare l'acido desossiribosio nucleico (DNA) secondo le istruzioni del produttore per il kit di preparazione midi/maxi con la seguente eccezione; durante la fase finale, eluire o risospendere il DNA con acqua (pH 7,0-8,5).
5. Controllare la concentrazione e la purezza del DNA mediante letture di assorbanza a 260 e 280 nm, quindi conservare il DNA a -20 °C.
   NOTA: Facoltativo (altamente consigliato): sequenziare il DNA utilizzando primer specifici per il vettore per confermare l'identità.

2. Trasfezione stabile di cellule HEK-293

1. Coltivare e mantenere le cellule HEK-293 (cellule in sospensione) secondo protocolli standard in terreni privi di siero integrati con lo 0,1% di tensioattivo non ionico in fiasche di Erlenmeyer. Mantenere a 2 x 10⁵ cellule/ml e sottocoltura ogni quattro giorni. Celle di coltura a 37 °C con anidride carbonica (CO₂) al 5% e rotazione a 120 giri/min.
   NOTA: Le cellule devono essere state in coltura per non meno di 4 giorni e non più di 4 settimane prima della trasfezione. Per questa procedura possono essere utilizzate anche cellule HEK-293 coltivate come monostrati in terreni contenenti siero.
2. Il giorno prima della trasfezione, seminare cellule HEK-293 a 3 x 10⁵ cellule/ml in pozzetti di una piastra a 12 pozzetti in 2 ml di Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS). Il giorno della trasfezione, verificare che le cellule abbiano raggiunto l'80-90% di confluenza
3. Diluire separatamente il DNA e la polietilenimmina (PEI) nel mezzo di trasfezione e poi mescolarli insieme.
   1. Diluire 1,25 μg di DNA vettoriale per pozzetto (15 μg per 12 pozzetti) in un terreno di trasfezione da 300 μl. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
   2. Diluire 2,5 μl di soluzione di PEI da 1 mg/ml (30 μl per 12 pozzetti, ossia un rapporto 1:2 tra DNA e PEI) in 300 μl di terreno di trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
   3. Aggiungere il DNA diluito al PEI diluito, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
4. Aggiungere 50 μl di miscela DNA/PEI goccia a goccia in ciascun pozzetto della piastra. Agitare delicatamente la piastra per distribuire la miscela di trasfezione, quindi posizionare la piastra a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
5. Aggiungere 50 μg/ml di igromicina B per pozzetto e riportare la piastra a 37 °C, 5% di CO₂ per 10 giorni.
   NOTA: Entro il decimo giorno, le cellule non trasfettate saranno morte e staccate dalla superficie della piastra, mentre le cellule trasfettate stabilmente saranno vitali e attaccate alla piastra.
6. Sostituire il terreno nei pozzetti con 1/4 di volume di terreno privo di siero e 3/4 di volume di DMEM integrato con il 10% di FBS (cioè 0,5 ml di terreno senza siero + 1,5 ml di DMEM = 7,5% di concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni.
7. Sostituire il terreno nei pozzetti con 1/2 volume di terreno privo di siero e 1/2 volume di DMEM integrato con il 10% di FBS (cioè 1 ml di terreno senza siero + 1 ml di DMEM = 5% di concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni.
8. Sostituire il terreno nei pozzetti con un terreno privo di siero da 3/4 di volume e DMEM da 1/4 di volume integrato con FBS al 10% (ovvero 1,5 ml di terreno senza siero + 0,5 ml di DMEM = 2,5% di concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni.
9. Sostituire il terreno nei pozzetti con 2 ml di terreno privo di siero integrato con tensioattivo non ionico allo 0,1% (cioè 0% di concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni.
   NOTA: Mantenere una pressione selettiva di 50 μg/ml di igromicina B sulle cellule durante l'adattamento senza siero. Le cellule adattate ai terreni privi di siero si staccano dalla superficie dei pozzetti e possono raggrupparsi in sospensione. Fare riferimento al passaggio 2.1 per le condizioni di coltura con l'integratore aggiuntivo di 50 μg/ml di igromicina B.
10. Utilizzando una pipetta, mescolare delicatamente le colture in sospensione nella piastra a 12 pozzetti e raggruppare le cellule in una provetta separata.
    1. Utilizzando un emocitometro, enumerare le cellule raggruppate e il seme in 30 ml di terreno privo di siero in un pallone di Erlenmeyer a 2 x 10⁵ cellule/ml. Colture di cellule a 37 °C con 5% di CO₂ e rotazione a 120 giri/min. sottocultura ed espandersi ogni quattro giorni.
11. Continuare ad espandere le dimensioni della coltura alla densità cellulare richiesta per ottenere 10 fiale a 1 x 10⁷ cellule/fiala per la crioconservazione in azoto liquido. Congelare le cellule in terreni privi di siero contenenti il 10% di dimetilsolfossido (DMSO).
    NOTA: I terreni condizionati contenenti anticorpi possono essere raccolti in ogni sottocoltura per confermare la produzione di proteine o utilizzati per ottimizzare le condizioni di purificazione. Per raccogliere i terreni condizionati e mantenere le cellule per la subcoltura, centrifugare la coltura a 300 x g per 5 minuti, quindi filtrare e sterilizzare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm. Il surnatante filtrato può essere conservato a 4 °C per 1-2 settimane o a -20 °C per una conservazione a lungo termine.

3. Produzione di anticorpi su larga scala da colture Batch Overgrow

NOTA: La produzione di anticorpi può essere seguita dal passaggio 2.11, dove le cellule esistenti vengono espanse alla densità cellulare richiesta in base al volume di coltura in eccesso di batch da impostare. In caso contrario, le cellule che sono state scongelate dalla crioconservazione iniziano in questa fase una volta espanse a una densità e un volume cellulari appropriati. Vari integratori di coltura possono essere utilizzati per ottimizzare la produzione di anticorpi; L'uso del triptone per aumentare la resa anticorpale è dimostrato in questo protocollo.

1. Semina di cellule a 2 x 10⁵ cellule/ml in 100 ml di terreno privo di siero in due fiasche di Erlenmeyer (per confrontare le rese di anticorpi da colture non integrate e nutrienti). Coltura a 37 °C, 5% CO₂ e 120 giri/min.
2. Dopo 24 ore, aggiungere il triptone a una concentrazione finale dello 0,5% alla coltura integrata con sostanze nutritive. Equalizzare il volume della coltura non integrata con terreni privi di siero.
3. Dall'8° giorno, eseguire quotidianamente la conta delle cellule delle colture utilizzando un emocitometro per monitorare la vitalità cellulare. Raccogliere i surnatanti di coltura una volta che la vitalità cellulare è inferiore all'80%.
   1. Raccogliere il surnatante mediante centrifugazione delle colture a 3.000 x g per 15 minuti, quindi sterilizzare con filtro il surnatante (contenente anticorpi) attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare i surnatanti a 4 °C (a breve termine) o congelare a -20 °C (a lungo termine).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Serie vettoriali pFUSE	N/A	InvivoGen	Geni anticorpali pesanti e leggeri espressi in vettori separati che richiedono la co-trasfezione.
Serie vettoriale mAbXpress	N/A	ACYTE Biotech Pty Ltd.	Geni anticorpali pesanti e leggeri espressi in vettori separati che richiedono la co-trasfezione. Fare riferimento a: Jones, M. L. et al. Un metodo per la riformattazione rapida e indipendente dalla legatura di anticorpi monoclonali ricombinanti. J Metodi immunol. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
vettore pVITRO1	N/A	N/A	I geni degli anticorpi pesanti e leggeri sono guidati ciascuno da un promotore separato in un singolo vettore. Fare riferimento a: Dodev, T. S. et al. Un kit di strumenti per il clonaggio rapido e l'espressione di anticorpi ricombinanti. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
Serie vettoriali GS	N/A	Lonza	Vettore multi-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto.
Serie vettoriale multi-cistronica 1	N/A	N/A	Vettore multi-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto. Fare riferimento a: Li, J. et al. Uno studio comparativo di diversi disegni di vettori per l'espressione nei mammiferi di anticorpi IgG ricombinanti. J Metodi immunol. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Serie vettoriale multi-cistronica 2	N/A	N/A	Vettore multi-cistronico con geni anticorpali pesanti e leggeri co-espressi e tradotti come singolo trascritto. Fare riferimento a: Ho, S. C. et al. Vettori tricistronici mediati da IRES per migliorare la generazione di linee cellulari CHO ad alta espressione di anticorpi monoclonali. J Biotecnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Codice 61883	Addgene	Vettore di espressione dei mammiferi contenente geni anticorpali trastuzumab con gene di resistenza all'igromicina; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ è stato un dono di Andrew Beavil.
Agar igrometrico a media veloce	fas-hg-s	Jomar Life Research	Utilizzato per preparare l'agar LB a basso contenuto di sale contenente 75 μg/ml di igromicina.
TB igrometrica per supporti rapidi	FAS-HG-L	Jomar Life Research	Utilizzato per preparare brodo di tubercolosi a basso contenuto di sale contenente 75 μg/ml di igromicina.
Glicerolo, BioXtra, ≥99%	G6279	Sigma-Aldrich	Preparare all'80% con acqua e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
Kit maxi plasmidi Jestar 2.0/LFU	G221020	Astrale Scientifico	Maxi Prep Kit; eluire o risospendere il DNA in acqua (pH 7,0-8,5).
Celle FreeStyle 293-F	R790-07	Tecnologie per la vita	Linea cellulare HEK-293 adattata alla coltura in sospensione in terreni privi di siero.
FreeStyle 293 Espressione Medium	Codice 12338-018	Tecnologie per la vita	Terreni privi di siero appositamente formulati per il mantenimento della linea cellulare 293-F e un'elevata espressione proteica.
Kolliphor P188	K4894	Sigma-Aldrich	Tensioattivo non ionico; F-68 pluronico; preparare al 10% in acqua e filtrare-sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 μm. Conservare a 4oC.
DMEM, glicemia alta	Codice 11995-065	Tecnologie per la vita
Siero fetale bovino inattivato a caldo	Codice 10082-147	Tecnologie per la vita
Polietilenimmina, lineare, MW 25.000	Codice 23966	Poliscienze, Inc.	Preparare a 1 mg/ml in acqua. Regolare a pH 7,0 con 1 M di HCl (la soluzione diventa limpida) e sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Conservare a -80oC fino al momento dell'uso.
OptiPro SFM	Codice 12309-050	Tecnologie per la vita	Terreni senza siero formulati per trasfezione
Soluzione di igromicina B	ANT-HG-1	Jomar Life Research
Dimetilsolfossido (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Scientifico
Triptone (peptone di caseina)	LP0042B	Thermo Fisher Scientifico	Preparare al 20% in PBS e sterilizzare con filtro da 0,22 μm. Conservare a 4oC.
Sistema BLItz	45-5000	fortéBIO	Strumento utilizzato per misure di interferometria a biostrato (BLI).