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1. Preparazione delle cellule criptococciche
- Strisciare l'organismo in esame con un'ansa di inoculazione su una piastra di agar sterile con estratto di lievito e malto (YM).
- Incubare la piastra di agar agar a 30°C per 48 ore.
- Utilizzare un ciclo di inoculazione per raccogliere 5 colonie singole e sospenderle in 5 ml di acqua distillata sterile.
- Standardizzare le cellule utilizzando uno standard McFarland per ottenere una concentrazione cellulare compresa tra 0,5 × 105 e 2,5 × 105 unità formanti colonie (CFU) per mL di terreno RPMI-1640.
- Erogare una sospensione cellulare da 100 μl in pozzetti di piastre per microtitolazione che contengono macrofagi seminati (vedere la sezione seguente).
2. Preparazione dei macrofagi
- Coltivare una linea cellulare di macrofagi murini, RAW 264.7, su un pallone di tessuto contenente 10 mL di terreno RPMI-1640, integrato con 20 mg/mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 20 U/mL di penicillina e il 10% di siero fetale bovino.
- Posizionare il pallone in un incubatore al 5% di CO2 impostato a 37°C fino a raggiungere l'80% di confluenza.
- Raschiare delicatamente le cellule usando un raschietto cellulare.
- Trasferire le cellule sospese in una provetta da centrifuga da 15 mL.
- Utilizzare la colorazione blu di tripano per determinare la vitalità cellulare.
nota: È preferibile un punteggio di vitalità superiore all'85%.
- Utilizzare un emocitometro per regolare la concentrazione cellulare dei macrofagi a 1 × 106 cellule/mL utilizzando una soluzione da 10 mL di terreno RPMI-1640 fresco e sterile.
- Erogare 100 μl di sospensione di cellule nei pozzetti di una piastra sterile per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti.
- Incubare la piastra per una notte in un incubatore al 5% di CO2 a 37°C.
nota: Prima dell'uso, il terreno di coltura trascorso durante la notte deve essere aspirato e sostituito con 100 μL di terreno fresco e sterile del Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640).
3. Preparazione del composto
- Sciogliere i fotosensibilizzatori di prova e la primachina (PQ) in acqua distillata per preparare una soluzione madre.
- Diluire ulteriormente il composto in RPMI-1640 media.
nota: La quantità finale di acqua distillata nei setti filtranti RPMI-1640 non deve mai superare l'1%.
- Erogare una soluzione da 100 μl del fotosensibilizzante preparato per quadruplicare la concentrazione desiderata in pozzetti appropriati contenenti i macrofagi e le cellule criptococciche già seminate.
4. Implementazione del trattamento fotodinamico (PDT)
- Impostare le seguenti condizioni sperimentali:
- Cellule in co-coltura con 0 μM di PQ ed esposte alla luce al buio (DL) per 2 minuti (cioè cellule non trattate (non Rx))
- Cellule co-coltivate con 6 μM ed esposte a DL per 2 minuti (ad es. effetto del farmaco)
- Cellule co-coltivate con 15 μM di PQ ed esposte a DL per 2 minuti (effetto del farmaco)
- Cellule co-coltivate con 30 μM di PQ ed esposte a DL per 2 minuti (ad esempio, effetto del farmaco)
- Cellule in co-coltura con 0 μM di PQ ed esposte ai raggi ultravioletti (UV) per 2 minuti (effetto UV)
- Cellule in co-coltura con 6 μM di PQ ed esposte alla luce ultravioletta (UVL) per 2 minuti (effetto PDT)
- Cellule co-coltivate con 15 μM di PQ ed esposte a UVL per 2 minuti (cioè effetto PDT)
- Cellule co-coltivate con 30 μM di PQ ed esposte a UVL per 2 minuti (cioè effetto PDT)
nota: Le cellule co-coltivate devono essere lasciate reagire con PQ per 30 minuti al buio (se applicabile), prima dell'esposizione ai raggi UVL (se applicabile).
nota: Nel lavoro attuale, abbiamo determinato che PQ ha un assorbimento UV/Vis di 260 nm, che è nella gamma UV della lampada germicida. A causa di quest'ultimo, abbiamo utilizzato una lampada ultravioletta germicida C (UVC) montata in una cabina di sicurezza biologica di Classe II come sorgente luminosa per implementare la PDT. Si dice che la lampada abbia una potenza nominale di 30 watt. Le celle sono state mantenute a circa 20 cm dalla lampada nel presente studio. A questa distanza, si stima che la lampada abbia un'emissione di radiazione di 625 μW/cm2.
5. Conteggio delle colonie per determinare la sopravvivenza delle cellule criptococciche
- Dopo aver iniziato il trattamento fotodinamico delle cellule in co-coltura come indicato sopra, incubare le piastre a 37°C in CO2 al 5 % per 18 ore.
- Dopo 18 ore, aspirare il surnatante.
- Lavare i pozzetti con 200 μl di soluzione tampone fosfato (PBS) per eliminare le cellule non internalizzate. Ripeti questo passaggio tre volte.
- Aggiungere 300 μl di Triton X-100 allo 0,1% ai pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aspirare il contenuto dei pozzetti e dispensarlo in provette di plastica sterili da 1,5 mL.
- Preparare una diluizione 1 su 10 delle celle con acqua distillata.
nota: Regolare la diluizione in modo che sia possibile recuperare tra le 30 e le 300 colonie su piastre di agar.
- Pipettare 50 μl della diluizione su una piastra di agar per malto di lievito (YM).
- Utilizzare un metodo di diffusione della piastra per creare un prato di confluenza di celle sulla superficie della piastra di agar.
- Incubare le piastre a 30°C per 48 ore.
- Contare le unità formanti colonie (CFU) sviluppate sulle piastre di agar.