L'effetto dell'aspirina e dell'ibuprofane sulla capacità fagocitaria dei macrofagi

Abstract

Questo video mostra un metodo per valutare l'impatto dell'aspirina e dell'ibuprofene, alle loro concentrazioni minime inibitorie, sulla fagocitosi dei macrofagi utilizzando cellule fungine colorate con colorante fluorescente sensibili al pH. I farmaci inibiscono la cicloossigenasi-2, diminuendo la formazione di prostaglandine e aumentando la fagocitosi dei macrofagi, come osservato attraverso misurazioni a fluorescenza di colorante sensibile al pH.

Protocollo

1. Considerazioni sulla sicurezza

1. Il personale deve utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI).
2. Maneggiare l'agente patogeno e i macrofagi in una cabina di sicurezza biologica di Classe II.

2. Preparazione dei macrofagi

1. Coltivare una linea cellulare di macrofagi murini, RAW 264.7, in un pallone di tessuto contenente 10 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), integrato con 20 mg/mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 20 U/mL di penicillina e il 10% di siero fetale bovino (FBS).
2. Posizionare il pallone in un incubatore al 5% di anidride carbonica (CO₂) impostato a 37°C fino a raggiungere l'80% di confluenza.
3. Raschiare delicatamente le cellule usando un raschietto cellulare.
4. Trasferire le cellule sospese in una provetta da centrifuga da 15 mL.
5. Utilizzare la colorazione blu di tripano per determinare la vitalità cellulare.
   nota: È preferibile un punteggio di vitalità superiore all'85%.
   Utilizzare un emocitometro per regolare la concentrazione cellulare dei macrofagi a 1 × 10⁵ cellule/mL utilizzando una soluzione da 10 mL di terreno RPMI-1640 fresco e sterile. Erogare 100 μL di sospensione di cellule nei pozzetti di una piastra sterile per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare la piastra per una notte in un incubatore al 5% di CO₂ a 37°C.
   nota: Prima dell'uso, il terreno trascorso durante la notte deve essere aspirato e sostituito con 100 μl di terreno RPMI-1640 fresco e sterile.

3. Preparazione delle cellule criptococciche

1. Strisciare l'organismo in esame con un'ansa di inoculazione su una piastra di agar sterile con estratto di lievito e malto (YM).
2. Incubare la piastra di agar agar a 30°C per 48 ore.
3. Utilizzando un ciclo di inoculazione, inoculare un anello di cellule in 100 ml di brodo di base azotata di lievito (YNB) integrato con glucosio al 4%.
4. Far crescere le cellule (pre-coltura) durante la notte agitando a 160 giri/min a 30°C.
5. Il giorno successivo, inoculare 0,1 mL di pre-coltura in brodo YNB fresco (coltura principale) e lasciare che le cellule crescano fino alla fase esponenziale media (nelle stesse condizioni di coltivazione).
6. Lavare le celle due volte con una soluzione tampone fosfato (PBS).
7. Utilizzando un emocitometro, standardizzare le cellule a 1 x 10⁵ in PBS.

4. Colorazione delle cellule criptococciche con la colorazione per fagocitosi

1. Erogare 999 μL di cellule in una provetta di plastica da 1,5 mL.
2. Aggiungere 1 μL del colorante verde zymosan A di pHrodo nella stessa provetta.
3. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 1 ora, al buio, agitando lentamente per reagire con la colorazione.
4. Al termine del periodo di incubazione, lavare le cellule tre volte con PBS.
5. Erogare una sospensione cellulare da 100 μl in pozzetti contenenti macrofagi seminati.

5. Preparazione di farmaci

1. Preparare una soluzione madre di aspirina utilizzando 1 mg di aspirina in 1000 mL di etanolo assoluto a una concentrazione finale di 1000 μg/mL.
2. Diluire ulteriormente il composto in terreno RPMI-1640 per raggiungere le concentrazioni di farmaco desiderate.
   nota: La quantità finale di etanolo nei terreni RPMI-1640 non deve mai superare l'1%. Preparare una soluzione madre di ibuprofene utilizzando 1 mg di ibuprofene in 1000 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Diluire ulteriormente il composto in terreno RPMI-1640 per raggiungere le concentrazioni di farmaco desiderate.
   nota: La quantità finale di DMSO nei supporti RPMI-1640 non deve mai superare l'1%. Preparare una soluzione da 100 μL dei farmaci preparati al quadruplo delle concentrazioni desiderate e dispensarla in pozzetti appropriati contenenti macrofagi seminati e cellule criptococciche.

6. L'effetto degli agenti chemio-sensibilizzanti sulla fagocitosi dei macrofagi

1. Incubare le piastre con cellule co-coltivate in presenza di agenti chemiosensibilizzanti, aspirina o ibuprofene in un incubatore al 5% di CO₂ a 37°C per 2 ore o 6 ore.
2. Al termine del periodo di incubazione, misurare la fluorescenza indotta (es: 492 nm e em: 538 nm).
   nota: La colorazione pHrodo diventa fluorescente solo in ambienti acidi, come all'interno del fagosoma.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
agar	Merck		Utilizzato per preparare le piastre YM
Estratto di lievito	Merck		Utilizzato per preparare le piastre YM
Estratto di malto	Merck		Utilizzato per preparare le piastre YM
peptone	Merck		Utilizzato per preparare le piastre YM
Lievito a base di azoto (YNB)	Laboratori Difco		Utilizzato nella coltivazione di cellule criptococciche
glucosio	Merck		Utilizzato per preparare le piastre YM
Macchia blu di Trypan	Sigma-Aldrich		Per enumerare le cellule vive e morte
Soluzione tampone fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich		Lavare e diluire le celle
RPMI- 1640 medio	Biochrom		Terreni di coltura per macrofagi
Siero fetale bovino (FBS)	Biochrom		Utilizzato per integrare il supporto RPMI-1640
Penicillina/Streptomicina/L-glutammina	Sigma-Aldrich		Aggiunto al supporto RPMI-1640
pHrodo zymosan verde A macchia	Tecnologie per la vita		Utilizzato per colorare le cellule internalizzate a causa di una variazione del pH
Acido acetilsalicilico (Aspirina)	Sigma-Aldrich		Il farmaco da testare
Etanolo assoluto	Merk		Usato per sciogliere l'aspirina
Ibuprofene	Sigma-Aldrich		Farmaco da testare
Dimetilsolfossido (DMSO)	Merk		Usato per sciogliere l'ibuprofene
Piastre per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti	Greiner Bio-One		Utilizzato come recipiente all'interno del quale venivano trasportate le reazioni
Pallone per fazzoletti	Lasec		Utilizzato per coltivare macrofagi
Provetta da centrifuga da 15 mL	Lasec		Utilizzato per contenere macrofagi
Raschiatore di celle	Lasec		Utilizzato per staccare i macrofagi dal pallone di tessuto
Ansa di inoculazione	Lasec		Utilizzato per striare la coltura sulla piastra di agar
Emocitometro	Marienfield		Per determinare la concentrazione cellulare dei macrofagi
Provette in plastica da 1,5 mL	Merck		Utilizzato come recipiente all'interno del quale venivano trasportate le reazioni
Spettrofotometro da ricerca EZ Read 800	Biochrom		Per leggere la densità ottica
Fluoroskan Ascent FL	Termo-Scientifico		Per misurare la fluorescenza
Incubatore a CO2	Termo-Fisher		Utilizzato per incubare i macrofagi
Cabina di sicurezza biologica di classe II	ESCO		Per lavorare in sicurezza con gli agenti patogeni senza causare danni all'utente.