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1. Preparazione delle cellule bersaglio per l'infezione
- Seminare le cellule bersaglio il giorno prima di eseguire l'esperimento in una piastra a 96 pozzetti (la piastra "bersaglio").
- Piastra un numero sufficiente di celle per pozzetto per garantire un mono>nota: Questo dipenderà dalla dimensione relativa del tipo di cella di destinazione. Se si utilizzano fibroblasti del prepuzio umano (HFF), seminare 20.000 cellule/pozzetto.
- In genere, devono essere seminati 21 pozzetti (7 in basso per 3 in larghezza) per campione, consentendo l'analisi di 4 campioni per piastra.
- Seminare altri 12 pozzetti per piastra (cioè la fila 8) per fungere da controlli.
2. Preparazione del virus: miscele di anticorpi
- Aggiungere 90 μl di terreno combinato con l'anticorpo (e ben miscelato) per ottenere il doppio della concentrazione di anticorpi di prova iniziale desiderata in 3 pozzetti della fila 1 di una piastra fresca da 96 pozzetti (la piastra di "diluizione").
nota: Una tipica concentrazione iniziale di anticorpi sarebbe di 20 μg/mL, ma dovrebbe essere determinata empiricamente.
- Aggiungere 60 μL di terreno a ciascuno dei 18 pozzetti sottostanti (cioè 6 verso il basso per 3 in larghezza) i 3 pozzetti del passaggio 2.1.
- Aggiungere 60 μl di terreno in 12 pozzetti aggiuntivi (ad esempio, la fila 8).
- Trasferire 30 μl di diluizione dell'anticorpo dalla fila 1 ai pozzetti corrispondenti nella fila 2.
- Miscelare il contenuto della riga 2 pipettando dolcemente su e giù 20 volte con la pipetta multicanale.
- Trasferire 30 μl di diluizione dell'anticorpo dalla fila 2 alla fila 3.
- Ripetere questo processo di miscelazione e trasferimento fino a quando il contenuto della riga 7 non è stato amalgamato.
- Una volta miscelata la fila 7, smaltire 30 μl dai pozzetti della fila 7.
- Diluire l'HCMV in un terreno completo in modo che 50 μL contengano particelle infettive sufficienti a provocare un'infezione MOI=1 se aggiunti direttamente alle cellule.
nota: L'HCMV è un patogeno della categoria di biosicurezza di livello 2 (BSL-2). Assicurarsi che siano in atto procedure di sicurezza adeguate e utilizzare i puntali del filtro per tutti i mezzi esposti all'HCMV.
nota: Ciò richiede lo stesso numero di particelle infettive del numero di cellule/pozzetto, che varierà in base al tipo di cellula e al tropismo del virus. Se si utilizzano HFF come descritto sopra, la concentrazione del virus richiesta è 4x105 pfu/mL.
nota: Assicurarsi che venga preparato un eccesso sufficiente di virus diluito (ad esempio, il 10% in più).
- Aggiungere 60 μl di stock virale diluito a tutti i pozzetti contenenti diluizioni di anticorpi e 6 pozzetti che contengono solo 60 μl di terreno.
- Aggiungere 60 μl di terreno solo ai restanti 6 pozzetti di terreno, per fungere da controlli non infetti.
- Incubare il virus risultante: miscele di anticorpi a 37oC per 1 ora.
3. Infezione delle cellule bersaglio
- Rimuovi tutti i supporti dalle celle di destinazione.
- Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 μl di miscela virus/anticorpo dalla piastra di "diluizione" sulle cellule nella posizione equivalente sulla piastra "target".
- Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
4. Fissazione delle cellule
- Rimuovi tutti i supporti da cells.
nota: A questo punto non è necessario cambiare le punte tra i pozzetti.
- Lavare tutti i pozzetti con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e rimuoverli.
- Aggiungere 180 μl -20 oC, etanolo al 100% a tutti i pozzetti.
- Incubare la piastra a -20 oC per almeno 30 min.
nota: Questo passaggio può essere esteso ad almeno un mese, a condizione che venga aggiunto ulteriore etanolo quando inizia a evaporare.
nota: Da questo momento in poi, la piastra è sicura da maneggiare in condizioni BSL-1 e possono essere utilizzati puntali senza filtro.
5. Rilevamento di cellule infettate viralmente mediante immunofluorescenza (IF)
- Rimuovere l'etanolo dalla piastra.
- Lavare tutti i pozzetti con 200 μL di PBS e rimuoverli.
- Aggiungere 200 μL di PBS a tutti i pozzetti e incubare per 5 minuti.
- Nel frattempo, preparare la diluizione degli anticorpi primari nel PBS.
- Saranno necessari 100 μl di anti-IE monoclonale di topo 1:2000 per pozzetto (si noti che la diluizione è per l'anticorpo specifico elencato nei materiali).
NOTA: Se viene utilizzata un'alternativa, potrebbe essere necessario ottimizzare la diluizione dell'anticorpo utilizzato per il digiuno intermittente.
- Miscela a vortice per garantire una miscelazione sufficiente.
- Rimuovere il PBS da tutti i pozzetti e aggiungere 100 μL di diluizione dell'anticorpo primario.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Rimuovere l'anticorpo primario da tutti i pozzetti.
- Aggiungere 200 μl di PBS e incubare per 5 minuti.
- Nel frattempo, preparare l'anticorpo secondario e la diluizione del 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS.
Per - pozzetto saranno necessari 100 μl di IgG anti-topo 1:2000 coniugate con fluorofori e 1 μg/mL di DAPI.
- NOTA: La diluizione dell'anticorpo secondario utilizzato per l'IF potrebbe richiedere un'ottimizzazione se viene utilizzata un'alternativa.
- Miscela a vortice per garantire una miscelazione sufficiente.
- Rimuovere il PBS da tutti i pozzetti e aggiungere 100 μL di anticorpo secondario/diluizione DAPI.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora, al riparo dalla luce.
- Rimuovere l'anticorpo secondario/DAPI da tutti i pozzetti.
- Lavare tutti i pozzetti con 200 μL di PBS e rimuoverli.
- Aggiungere 200 μL di PBS a tutti i pozzetti e incubare per 5 minuti.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 100 μL di PBS a tutti i pozzetti e conservarlo, al riparo dalla luce, a 4 oC fino al momento dell'immagine.
nota: Le lastre possono essere conservate fino a un mese con una perdita minima di qualità del segnale/immagine.
6. Imaging e conteggio delle cellule infette
- Per quantificare l'infezione in modo semplice e accurato, visualizzare almeno il 25% di ciascun pozzetto, sia nel canale blu (DAPI, nuclei) che in quello secondario (HCMV proteine immediate-early (IE)).
nota: Il segnale generato dall'immunofluorescenza IE dovrebbe assomigliare a quello della colorazione nucleare e le immagini dovrebbero essere controllate per confermarlo.
- Questa operazione può essere eseguita manualmente, ma si consiglia l'uso di un microscopio automatizzato.
nota: L'ingrandimento dipende dallo strumento, ma poiché vengono riprodotte grandi strutture (nuclei), gli obiettivi 4X/10X sono in genere sufficienti.
- Una volta acquisite le immagini, elaboratele attraverso il programma di analisi software scelto.
- Innanzitutto, identifica i nuclei tramite il canale blu, per calcolare il numero di cellule presenti.
- Solo queste aree devono quindi essere controllate per il segnale nel canale rosso, poiché l'IE è una proteina localizzata nucleare, per calcolare il numero di cellule infette.
- Una volta calcolato il numero di cellule infette e il numero totale di cellule, calcolare la percentuale di infezione per pozzetto.
- Questi valori possono essere corretti per i livelli di rilevamento di fondo sottraendo la percentuale media di infezione osservata nei pozzetti non infetti da tutti gli altri pozzi.
nota: Questo dovrebbe essere ben al di sotto dell'1%. Se è superiore all'1%, la procedura di analisi richiede l'ottimizzazione.
- Questi valori corretti per lo sfondo possono ora essere tracciati, interrogati e analizzati a piacere.