Rilevazione quantitativa multiplexata di batteri mediante microsfere magnetiche marcate con colorante

Abstract

Questo video mostra la rilevazione quantitativa multiplex di batteri utilizzando microsfere di polistirene magnetico carbossilato colorate in set distinti. La procedura comprende la formazione di complessi perline-batteri, la separazione magnetica e l'analisi basata sul flusso, consentendo una quantificazione precisa e simultanea di più batteri nello stesso pozzetto di reazione.

Protocollo

1. Accoppiamento covalente di anticorpi di cattura con microsfere MagPlex

Ogni anticorpo di cattura viene coniugato a uno specifico set di microsfere magnetiche carbossilate utilizzando una procedura in due fasi come descritto di seguito.

NOTA: È disponibile anche un kit di accoppiamento che include tutti i reagenti, i tamponi e i materiali necessari per l'accoppiamento delle microsfere (vedi TABELLA DEI MATERIALI).

1. Risospendere la sospensione di microsfere disaccoppiate di serie secondo le istruzioni descritte nella scheda informativa del prodotto fornita con le microsfere.
   nota: Le istruzioni per la risospensione dipenderanno dalle dimensioni e dal volume delle fiale di microsfere di serie.
2. Trasferire 2,5 x 10⁶ delle microsfere stock in una provetta da microcentrifuga consigliata (vedere TABELLA MATERIALI).
3. Posizionare il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 secondi.
4. Con il tubo ancora posizionato nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante.
   nota: Fare attenzione a non disturbare le microsfere.
5. Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospendere le microsfere in 100 μL di dH₂O mediante vortice e sonicazione per 20 secondi.
6. Ripetere i passaggi 3 e 4.
7. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le microsfere lavate 80 μL di fosfato di sodio monobasico 0,1 M, pH 6,2 a vortice e sonicazione per 20 secondi.
8. Aggiungere 10 μL di 50 mg/mL di N-idrossisulfosuccinimide (sulfo-NHS) (diluito in sodio fosfato monobasico 0,1 M, pH 6,2) alle microsfere e mescolare delicatamente a vortice.
9. Aggiungere 10 μL di 50 mg/mL di 1-Etil-3-[3-dimetilamminopropil]carbodiimmide cloridrato (EDC) (diluito in sodio fosfato monobasico 0,1 M, pH 6,2) alle microsfere e mescolare delicatamente a vortice.
10. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente mescolando delicatamente a vortice a intervalli di 10 minuti.
11. Posizionare il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 secondi.
12. Con il tubo ancora posizionato nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante.
    nota: Fare attenzione a non disturbare le microsfere.
13. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le microsfere in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) da 250 μl, pH 7,4 mediante vortice e sonicazione per circa 20 secondi.
14. Posizionare il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 secondi.
15. Con il tubo ancora posizionato nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante.
    nota: Fare attenzione a non disturbare le microsfere.
16. Ripetere i passaggi 13-15 per un totale di due lavaggi.
17. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le microsfere attivate e lavate in 100 μL di PBS, pH 7,4 a vortice e sonicazione per circa 20 secondi.
18. Aggiungere 12,5 μg di anticorpo di cattura alle microsfere risospese (cioè 5 μg/1 milione di microsfere).
    nota: Gli anticorpi monoclonali sono preferiti per la cattura, ma possono essere utilizzati anche anticorpi policlonali.
    NOTA: 5 μg di proteine per 1 milione di perle in genere funzionano bene, ma si consiglia di titolare la quantità per ottenere prestazioni ottimali del saggio.
19. Portare il volume totale a 500 μl con PBS, pH 7,4.
20. Mescolare la reazione di accoppiamento da un vortice.
21. Incubare per 2 ore mescolando a rotazione a temperatura ambiente al buio.
22. Posizionare il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 secondi.
23. Con il tubo ancora posizionato nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante.
    nota: Fare attenzione a non disturbare le microsfere.
24. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le microsfere accoppiate in 1 ml di PBS, pH 7,4 contenente 0,02% Tween-20, 0,1% albumina sierica bovina (BSA), 0,05% azoturo di sodio (PBS-TBN) mediante vortice e sonicazione per 20 secondi.
25. Posizionare il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 secondi.
26. Con il tubo ancora posizionato nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante.
    nota: Fare attenzione a non disturbare le microsfere.
27. Ripetere i passaggi 24-26 per un totale di due lavaggi.
28. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le microsfere accoppiate in 500 μL di PBS-TBN.
    nota: Determinare il numero di microsfere recuperate utilizzando un contatore di cellule o un emocitometro.
29. Conservare le microsfere accoppiate in frigorifero a 2-8°C al buio.
    nota: È disponibile anche un protocollo per confermare l'efficienza dell'accoppiamento.

2. Marcatura della biotina degli anticorpi di rilevamento

1. Gli anticorpi di rilevamento sono stati marcati con biotina utilizzando EZ-Link sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido) esanoato secondo le istruzioni del produttore con un eccesso molare di 20 volte di reagente di biotina per ottenere 4-6 gruppi di biotina per molecola di anticorpo><. nota: Gli anticorpi policlonali sono tipicamente utilizzati per la rilevazione, ma possono essere utilizzati anche anticorpi monoclonali se specifici per un epitopo diverso dall'anticorpo di cattura><. nota: In alternativa, per la rilevazione possono essere utilizzati anticorpi biotinilati disponibili in commercio.

3. Rilevamento di organismi mediante test immunologico a sandwich di cattura multiplexata

I set di microsfere accoppiate e gli anticorpi di rilevamento marcati generati in 1 e 2 sopra vengono utilizzati in un test immunologico a sandwich di cattura multiplex per rilevare e quantificare i batteri presenti in un campione. Una panoramica del flusso di lavoro del saggio è mostrata nella Figura 1.

1. Selezionare le fiale di serie di set di perline MagPlex accoppiate ad anticorpi da 2-8ºC di conservazione.
2. Vortice e sonica per 20 secondi.
3. Preparare una miscela di microsfere multiplexata di lavoro in modo che ogni set di microsfere raggiunga una concentrazione finale di 2500 microsfere per 50 μl per ciascun pozzetto di reazione (50.000 biglie / set / ml) in PBS-TBN.
   nota: Utilizzare un foglio di calcolo per determinare i parametri di preparazione per la miscela di perline di lavoro.
   nota: Possono essere incluse anche microsfere di controllo interno (microsfere monitor RP1) per monitorare le prestazioni del saggio e dello strumento.
4. Pipettare 50 μl di miscela di perline di lavoro nei pozzetti appropriati di una piastra a 96 pozzetti.
5. Pipettare 50 μl di standard o campione in pozzetti appropriati.
6. Pipettare 50 μl di PBS-TBN in ciascun pozzetto di fondo.
7. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere le perle dalla luce e incubare su uno shaker a temperatura ambiente per 1 ora agitando a 800 giri/min.
8. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per 1 minuto.
9. Mantenendo la piastra sul separatore magnetico della piastra, rimuovere con cura la pellicola e capovolgere la piastra per svuotare i pozzetti, quindi picchiettare per asciugare su uno spesso strato di carta assorbente da laboratorio 3-4 volte.
   nota: In alternativa, aspirare manualmente i pozzetti utilizzando un pipettatore multicanale o utilizzare una lavatrice automatica per piastre.
10. Utilizzare un pipettatore multicanale per aggiungere 200 μl di PBS-TBN a ciascun pozzetto e agitare per 1 minuto su un agitatore a piastre a 800 giri/min.
11. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per 1 minuto.
12. Tenendo la piastra sul separatore magnetico della piastra, capovolgere la piastra per svuotare i pozzetti, quindi picchiettare per asciugare su uno spesso strato di carta assorbente da laboratorio 3-4 volte.
    nota: In alternativa, aspirare manualmente i pozzetti utilizzando un pipettatore multicanale o utilizzare una lavatrice automatica per piastre.
13. Ripetere i passaggi 10-12 per un totale di due lavaggi.
    nota: Rimuovere quanto più tampone possibile prima di procedere alla fase successiva per evitare una potenziale diluizione della reazione.
14. Utilizzare un pipettatore multicanale per aggiungere 50 μl di tampone per il saggio a ciascun pozzetto e agitare per 1 minuto su un agitatore a piastre a 800 giri/min.
15. Diluire l'anticorpo di rilevazione biotinilato a 4 μg/ml in PBS-TBN.
16. Aggiungere 50 μl dell'anticorpo di rilevamento diluito a ciascun pozzetto.
17. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere le perle dalla luce e incubare su uno shaker a temperatura ambiente per 1 ora agitando a 800 giri/min.
18. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per 1 minuto.
19. Tenendo la piastra sul separatore magnetico della piastra, capovolgere la piastra per svuotare i pozzetti, quindi picchiettare per asciugare su uno spesso strato di carta assorbente da laboratorio 3-4 volte.
    nota: In alternativa, aspirare manualmente i pozzetti utilizzando un pipettatore multicanale o utilizzare una lavatrice automatica per piastre.
20. Lavare ogni pozzetto due volte seguendo la procedura descritta nei passaggi 10-12.
    nota: Rimuovere quanto più tampone possibile prima di procedere alla fase successiva per evitare una potenziale diluizione della reazione.
21. Utilizzare un pipettatore multicanale per aggiungere 50 μl di tampone per il saggio a ciascun pozzetto e agitare per 1 minuto su un agitatore a piastre a 800 giri/min. Streptavidina, R-ficoeritrina coniugato (SAPE).
22. Diluire il reporter SAPE a 4 μg/mL nel tampone del saggio.
23. Aggiungere 50 μl di SAPE diluito a ciascun pozzetto.
24. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere le perle e il SAPE dalla luce e incubare su uno shaker a temperatura ambiente per 30 minuti agitando a 800 giri/min.
25. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per 1 minuto.
26. Tenendo la piastra sul separatore magnetico della piastra, capovolgere la piastra per svuotare i pozzetti, quindi picchiettare per asciugare su uno spesso strato di carta assorbente da laboratorio 3-4 volte.
    NOTA: In alternativa, aspirare manualmente i pozzetti utilizzando un pipettatore multicanale o utilizzare una lavatrice automatica per piastre.
27. Lavare ogni pozzetto due volte seguendo la procedura descritta nei passaggi 10-12.
28. Aggiungere 100 μL di PBS-TBN a ciascun pozzetto e agitare per 1 minuto su un agitatore a piastre a 800 giri/min.
29. Analizzare 50 μl di ciascuna reazione sull'analizzatore Luminex (secondo il manuale utente dell'analizzatore utilizzato), raccogliendo un minimo di 50 microsfere per ogni set di perle per l'analisi. Di seguito viene fornita una breve descrizione di xMAP INTELLIFLEX®.
    1. Selezionare il menu a discesa nell'angolo in alto a sinistra dello schermo e accedere a Configurazione targa.
    2. Selezionare Esegui piastra.
    3. Selezionare l'icona Espelli per espellere il portapiatti.
    4. Caricare la piastra sul portatarga e selezionare l'icona Ritrai per ritrarre il portapiatti.
    5. Selezionare l'icona Esegui per far scorrere la piastra.

Risultati

Figura 1: Flusso di lavoro del saggio immunologico a sandwich di cattura multiplexata. Una miscela multiplex di microsfere accoppiate ad anticorpi viene dispensata in ciascun pozzetto e il campione viene aggiunto. Dopo l'incubazione per 1 ora, le reazioni vengono lavate e vengono aggiunti gli anticorpi di rilevamento biotinilati. Dopo un'incubazione di 1 ora, le reazioni vengono nuov...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microsfere MagPlex®	Luminex®	MC100xx-YY	Consultare il sito Web per i singoli numeri di catalogo (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order)
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Eppendorf™	22431081	Proteina LoBind®
0,1 M di fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4), pH 6,2	MilliporeSigma	Episodio 3139	Buffer di attivazione
cloridrato di 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil]carbodiimmide (EDC)	Termo Scientifico™	Pierce™ 77149
N-idrossisulfosuccinimide (Sulfo-NHS)	Termo Scientifico ™	Pierce™ 24510
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4	MilliporeSigma	P3813	Buffer di accoppiamento
Kit di accoppiamento anticorpo xMAP®	Luminex®	40-50016	Kit opzionale disponibile per l'accoppiamento a microsfere.
Anticorpo anti-Escherichia coli O157:H7	SeraCare	Codice: 5310-0326	Policlonale, utilizzato sia per l'acquisizione che per il rilevamento
Anticorpo anti-Salmonella CSA-Plus	SeraCare	Codice: 5310-0321	Policlonale, utilizzato sia per l'acquisizione che per il rilevamento
Anticorpo anti-Campylobacter spp.	SeraCare	Codice: 5310-0324	Policlonale, utilizzato sia per l'acquisizione che per il rilevamento
Anticorpo anti-Listeria	SeraCare	Codice: 5310-0319	Policlonale, genere-specifico, utilizzato sia per la cattura che per il rilevamento
PBS, pH 7,4 contenente 0,02% Tween-20, 0,1% BSA, 0,05% sodio azide (PBS-TBN)	MilliporeSigma	P3563 A7888 S8032	Può essere utilizzato fino all'1% di BSA
Anticorpo anti-Escherichia coli O157:H7	SeraCare	Codice: 5310-0326	Policlonale
(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina) (Pierce).	Termo Scientifico™	Codice A39257
E. coli O157:H7	SeraCare	Codice: 5370-0013	Ucciso a caldo
Salmonella sierotipo Typhimurium	SeraCare	Codice: 5370-0002	Ucciso a caldo
Campylobacter jejuni	SeraCare	Codice: 5370-0011	Ucciso a caldo
Listeria monocytogenes	SeraCare	5370-0010	Ucciso a caldo
Streptavidina, R-ficoeritrina coniugato (SAPE)	Termo Scientifico™	S866