Isolamento e digestione delle proteine neutrofile

Abstract

Questo video dimostra l'isolamento delle proteine dai neutrofili, che vengono ulteriormente elaborate e digerite in peptidi più piccoli. Questi peptidi possono essere utilizzati per analisi future.

Protocollo

1. Raccolta e lisi delle cellule neutrofile

1. Raccogliere le cellule HL60 differenziate con neutrofili in una provetta da 15 mL centrifugando i campioni a 400 x g per 5 minuti.
   nota: I neutrofili dovrebbero essere a una confluenza di 3,5 x 10⁵ cellule/mL dopo la differenziazione. Raccogliere circa cinque milioni di cellule per l'estrazione totale del proteoma.
2. Eliminare il surnatante e aggiungere 15 mL di soluzione tamponata con fosfato (PBS) nella provetta.
3. Centrifugare i campioni a 400 x g per 5 min.
4. Ripetere i passaggi da 1.2 a 1.3.
   nota: I campioni cellulari possono essere congelati con azoto liquido e conservati a -80°C dopo la fase 1.4, a seconda del periodo di tempo sperimentale.
5. Aggiungere a ciascun campione 300 μl di Tris (idrossimetil) amminometano cloridrato (Tris-HCl) 100 mM freddo pH 8,5 contenente una compressa di cocktail di inibitori della proteinasi (PIC).
6. Esempi di vortice in breve.
7. Aggiungere 1/10 di volume di SDS al 20% a una concentrazione finale di SDS al 2%.
8. Per lisare i campioni cellulari, sonare i campioni sonicati in un bagno di ghiaccio per 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento per cinque cicli al 10% di potenza.
9. Centrifugare i campioni con una centrifuga breve (velocità massima per 5-10 secondi).
   nota: Non lasciare che i detriti della cella si blocchino. Utilizzare una breve centrifuga per raccogliere lo spray dalle pareti del tubo.
10. Trasferire i campioni dalla provetta da 15 mL in una provetta da 2 mL.
11. Aggiungere 1/10 di volume di 1 M di ditiotreitolo stock (DTT) a una concentrazione finale di 10 mM di DTT.
12. Esempi di vortice in breve.
13. Incubare i campioni per 10 minuti con agitazione a 800 giri/min a 95°C.
14. Dopo 10 minuti, raffreddare i campioni a temperatura ambiente.
    nota: I campioni possono essere posti nel ghiaccio per accelerare il processo di raffreddamento.
15. Aggiungere 1/10 di volume di 0,55 mM di iodoacetammide (IAA) a una concentrazione finale di 55 mM IAA.
    nota: Eseguire il passaggio 1.15 al buio per evitare di esporre l'IAA alla luce.
16. Esempi di vortice in breve.
17. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
18. Aggiungere acetone ghiacciato al 100% a una concentrazione finale dell'80% e conservare i campioni a -20 °C per una notte.
    nota: Se necessario, lo stoccaggio a -20 °C può essere effettuato per un massimo di due settimane.

2. Digestione delle proteine neutrofile

1. Centrifugare i campioni a 13.500 giri/min a 4°C per 10 minuti per far precipitare i pellet cellulari.
2. Scartare il surnatante e lavare i pellet della cella con 500 μl di acetone ghiacciato all'80%.
3. Centrifugare i campioni a 13.500 giri/min a 4 °C per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
4. Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.3.
5. Pellet essiccati all'aria.
6. Una volta asciutto, aggiungere 100 μl di acido 8 M Urea/40 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) al pellet cellulare e sonicare in acqua in un bagno d'acqua a 4°C per 30 secondi di accensione, per 15 cicli per risolubilizzare i pellet proteici.
7. Utilizzando il test dell'albumina sierica bovina (BSA) triptofano (o equivalente) si quantifica la concentrazione proteica secondo le istruzioni del produttore.
8. Aggiungere 300 μl di bicarbonato di ammonio (ABC) per diluire il campione fino a una concentrazione finale di 2 M di urea.
9. Per digerire 50 μg di proteine, aggiungere 1:50 di tripsina/lisc (rapporto enzima/proteine) ai campioni su ghiaccio: mescolare i campioni picchiettando delicatamente.
10. Incubare i campioni a temperatura ambiente per una notte per eseguire la digestione.

Risultati

Figura 1. Flusso di lavoro delle cellule HL60 differenziate in neutrofili per la profilazione proteomica basata sulla spettrometria di massa. Le linee cellulari HL60 indifferenziate e differenziate (tramite stimolazione chimica con DMSO) sono state coltivate, raccolte e processate per l'estrazione totale del proteoma. Le proteine sono state digerite con tripsina/LysC e i peptidi sono stati purificati...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo Falcon da 15 ml	VWR	Codice 470225-000
25 mL sierologico	Fisher Scientifico	14955235
Bicarbonato di ammonio (ABC)	ThermoFisher Scientifico	A643-500
acetone	Sigma Aldrich	34850-1L
Kit di test BSA	VWR	CA62408-940
Centrifuga 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitolo (DTT)	ThermoFisher Scientifico	R0861	Preparare una scorta di 1 milione di aliquote DTT e conservarla a -20°C
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher Scientifico	12483020	Scongelare, preparare le aliquote e conservare a -20°C
Blocco riscaldante
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Preparare aliquote 8M Urea/40M HEPES, conservare a -20 °C
Iodoacetammide (IAA)	Fisher Scientifico	AAA1471514	Preparare una scorta di 0,55 milioni di aliquote IAA e conservarla a -20°C. Evitare l'esposizione alla luce
L-glutammina	Fisher Scientifico	25030081	Scongelare, preparare le aliquote e conservare a -20°C
azoto liquido
Provette per microcentrifuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
Penicillina Streptomicina, Amfotericina	Sigma Aldrich	Codice: A5955	Scongelare, preparare le aliquote e conservare a -20°C
Cellule HL60 differenziate con neutrofili
Soluzione tamponata con fosfato (PBS)	Bioshop	PBS408	Conservare a temperatura ambiente
Sonicatore a sonda	Fisher Scientifico	100-132-894
Compressa di cocktail di inibitori della proteasi (PIC)	Sigma Aldrich	5892791001	Conservare a 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientifico	11875093	Conservare a 4°C
Dodecil solfato di sodio (SDS)	ThermoFisher Scientifico	J18220. A1	preparare una soluzione SDS al 2%
Centrifuga SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Palloni T75	ThermoFisher Scientifico	156499
Tris HCL pH 8.5	Fisher Scientifico	BP152-1	Conservare a 4°C
Bagno ad ultrasuoni	VWR	97043-960
urea	Bioshop	URE001.1