Procedura di punta A STAGE per la desalinizzazione e la purificazione dei peptidi

Abstract

Questo video mostra la purificazione dei peptidi attraverso la procedura STAGE Tip. Una colonna in miniatura contenente perle di resina legate a lunghe catene di idrocarburi facilita la purificazione basata sull'interazione idrofobica. Dopo aver caricato un campione di peptide predigerito nella colonna, i frammenti di peptidi si legano alle perle di resina, consentendo il passaggio delle impurità. Per eluire i frammenti peptidici viene applicato un tampone di eluizione che interrompe l'interazione idrofobica.

Protocollo

1. Purificazione e desalinizzazione dei peptidi

1. Impacchettare tre strati di resina C18 in un puntale per pipetta da 200 μl per ciascun campione di peptide per costruire un puntale STop And Go Extraction (STAGE).
2. Aggiungere ai campioni 1/10 di soluzione di arresto (acetonitrile [ACN] al 20% e acido trifluoroacetico [TFA] al 6%).
3. Campioni di centrifuga per la precipitazione di pellet a 13.200 giri/min per 10 min.
4. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2 ml ed eliminare il pellet.
5. Lavare i puntali con 100 μl di ACN al 100%.
6. Centrifugare puntali STAGE a 1000 x g per 2 min.
   nota: Centrifugare le punte STAGE fino a quando tutto il liquido non è passato attraverso la resina C18.
7. Lavare i puntali STAGE con 50 μl di tampone B (80% ACN, 0,5% acido acetico e ddH₂O).
8. Centrifugare le punte STAGE a 1000 x g per 2 min.
9. Lavare i puntali STAGE con 200 μl di tampone A (2% ACN, 0,1% TFA, 0,5% acido acetico e ddH₂O).
10. Centrifugare le punte della fase a 1000 x g per 2 min.
11. Caricare i campioni nelle punte STAGE.
12. Centrifugare i campioni a 1000 x g per 3-5 min.
13. Lavare i puntali STAGE con 200 μl di Buffer A.
14. Centrifugare a 1000 x g per 3-5 min.
15. Aggiungere 50 μl di tampone B in ciascun puntale STAGE
16. Utilizzando una siringa, eluire i campioni contenenti il tampone B in una provetta per PCR da 0,2 mL.
17. Una volta eluiti i campioni, essiccare i peptidi utilizzando una centrifuga sottovuoto per 45 minuti.
18. Una volta che i campioni sono asciutti, conservarli a temperatura ambiente fino a MS.
    nota: Se è necessario conservare i peptidi per più di due settimane, si consiglia di conservarli a -20°C.
19. Eseguire il campione su una spettrometria di massa ad alta risoluzione (MS).
    nota: I parametri di misurazione del campione (ad esempio, quantità di campione caricato, lunghezza del gradiente della cromatografia liquida, risoluzione) dipenderanno dalla strumentazione utilizzata.

2. Profilazione proteomica dei neutrofili

1. Elaborazione dei dati grezzi
   1. Caricate i file di dati grezzi ottenuti da MS in MaxQuant.
   2. Il software è progettato per funzionare con file di acquisizione bottom-up, dipendenti dai dati, e molti parametri predefiniti sono ottimizzati per tali campioni. I parametri predefiniti includono la digestione (tripsina P), le modifiche variabili dell'ossidazione della metionina (ossidazione (M)) e la N-acetilazione delle proteine (acetil (proteina N-termine)) e le modifiche fisse della carbamidometilazione della cisteina (carbamidometile (C)).
   3. Le regolazioni di questi parametri includono la quantificazione senza marcatura (LFQ; impostare il conteggio del rapporto minimo su 1), la corrispondenza tra le esecuzioni (ad esempio, on/off) e un numero minimo di peptidi identificati per proteina (si consiglia di impostare su 2).
   4. Nei parametri globali, importare il file FASTA per l'identificazione della sequenza. Per questo esperimento, è stato utilizzato il file FASTA Homo sapiens (Human) (UP000005640) dal database Uniprot. nota: Registrare le seguenti informazioni per la registrazione: ID organismo = 9606; il numero di proteine = 79.740; Data di download del file.
   5. Impostare il numero di core del computer da utilizzare per l'elaborazione e selezionare Avvia.
   6. Al completamento di MaxQuant, verrà generata una cartella "combinata", insieme ad altri file.
      nota: Gli altri file possono essere utilizzati per identificare peptidi, modifiche, ecc. e possono essere necessari per caricare l'intero set di dati su archivi di dati, tra cui Proteome Xchange (PRIDE).
2. Analisi e visualizzazione dei dati in Perseus
   1. Carica il 'proteingroups.txt' in Perseus e seleziona tutti i file di intensità LFQ per la finestra 'Principale'.
      nota: Le informazioni di base vengono importate direttamente nelle finestre di Perseus, ma potrebbe essere necessario aggiungere manualmente altre informazioni (ad esempio, i siti di modifica).
   2. Filtrare le file rimuovendo contaminanti, peptidi inversi e peptidi identificati solo per sito.
   3. Trasformare i dati in base al log₂(x).
   4. Per osservare il numero di proteine rilevate in ogni replicato, costruire un diagramma di Venn numerico.
   5. Imposta annotazioni categoriche per ogni campione.
      nota: A fini statistici, tutte le repliche di un campione biologico dovrebbero avere lo stesso nome.
   6. Filtrare le righe in base a valori validi, con la proteina identificata nel >50% delle repliche e all'interno di almeno un gruppo.
      nota: Il filtraggio in base a valori validi può essere più rigoroso, a seconda della configurazione e degli obiettivi dell'esperimento (ad esempio, le proteine devono essere presenti in tutti i campioni).
   7. Per sostituire i valori mancanti per LFQ, è possibile eseguire l'imputazione dalla distribuzione normale.
      NOTA: i parametri predefiniti sono ottimizzati per i dati LFQ ma possono essere regolati a piacere.
   8. Aggiungere informazioni di annotazione alle righe proteiche. Aggiungi il file FASTA txt.gz (ottenuto dal sito web di Perseus) nelle cartelle 'bin', 'conf' e 'annotation' e inserisci termini specifici (ad esempio, nomi di proteine, nomi di geni, ontologia genetica).
   9. La matrice è ora completa e può essere utilizzata per test statistici (ad esempio, ANOVA, t-test) per determinare cambiamenti significativi nell'abbondanza proteica tra le condizioni testate. Altre forme di strumenti di visualizzazione includono grafici di analisi dei componenti principali, mappe di calore e arricchimento delle categorie.
      nota: Le informazioni sulle annotazioni possono anche essere scaricate da UniProt e integrate nel framework Perseus.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo Falcon da 15 ml	VWR	Codice 470225-000
25 mL sierologico	Fisher Scientifico	14955235
Bicarbonato di ammonio (ABC)	ThermoFisher Scientifico	A643-500
acido acetico	Sigma Aldrich	1099510001
acetone	Sigma Aldrich	34850-1L
Acetonitrile (ACN), grado MS	perforare	TS-51101
Kit di test BSA	VWR	CA62408-940
Dischi C18 (punte STAGE)	Fisher Scientifico	13110019
Centrifuga 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Ditiotreitolo (DTT)	ThermoFisher Scientifico	R0861	Preparare una scorta di 1 milione di aliquote DTT e conservarla a -20°C
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher Scientifico	12483020	Scongelare, preparare le aliquote e conservare a -20°C
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Preparare aliquote 8M Urea/40M HEPES, conservare a -20 °C
Spettrometro di massa ad alta risoluzione	ThermoFisher Scientifico	726042
Iodoacetammide (IAA)	Fisher Scientifico	AAA1471514	Preparare una scorta di 0,55 milioni di aliquote IAA e conservarla a -20°C. Evitare l'esposizione alla luce
L-glutammina	Fisher Scientifico	25030081	Scongelare, preparare le aliquote e conservare a -20°C
Provette per microcentrifuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Provette per strisce PCR	VWR	76318-802
Penicillina Streptomicina, Amfotericina	Sigma Aldrich	Codice: A5955	Scongelare, preparare le aliquote e conservare a -20°C
Perseo	https://www.maxquant.org/Perseus/
soluzione tamponata con fosfato (PBS)	Bioshop	PBS408	Conservare a temperatura ambiente
Sonicatore a sonda	Fisher Scientifico	100-132-894
Compressa di cocktail di inibitori della proteasi (PIC)	Sigma Aldrich	5892791001	Conservare a 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientifico	11875093	Conservare a 4°C
Dodecil solfato di sodio (SDS)	ThermoFisher Scientifico	J18220. A1	preparare una soluzione SDS al 2%
Centrifuga SpeedVac	Eppendorf	07-748-15
Centrifuga ribaltabile STAGE	Sonazione	STC-V2
Palloni T75	ThermoFisher Scientifico	156499
Acido trifluoroacetico	ThermoFisher Scientifico	Codice 85183
Tris HCL pH 8.5	Fisher Scientifico	BP152-1	Conservare a 4°C
tripsina/lisca	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A40009	aliquotare e conservare a -20°C
Bagno ad ultrasuoni	VWR	97043-960
urea	Bioshop	URE001.1