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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Saggio di neutralizzazione basato su pseudotipi
NOTA: pMN è l'inibizione della trasduzione mediata dal virus pseudotipo (PV) attraverso campioni di siero umano convalescente che contengono anticorpi diretti contro il SARS-CoV-2 Spike.
- In una piastra bianca a 96 pozzetti con l'ausilio di una pipetta multicanale, aggiungere 50 μl di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero fetale bovino (FBS), 1% penicillina/streptomicina (Pen/Streptoman) alle righe da B a H, colonne 1-12.
- Aggiungere 5 μl di siero convalescente nei pozzetti della riga A, colonne 2-10, in un volume totale di 100 μl di DMEM/10% FBS/1% P/S. Aggiungere una quantità nota (ad es. 5 μl) di antisieri positivi (calibrante NIBSC 20/162, HICC-pool 2 o pool HICC 3) e negativi (sieri del paziente prelevati prima del 2019) nei pozzetti A11 e A12 come controlli.
- Rimuovere 50 μl dai pozzetti della fila A ed eseguire diluizioni seriali doppie lungo tutti i pozzetti sottostanti.
- Ad ogni fase di diluizione, utilizzare una pipetta multicanale per miscelare 5-10 volte pipettando su e giù e facendo attenzione a non produrre bolle d'aria.
- Dopo aver completato la diluizione in serie, gli ultimi 50 μl dal pozzetto finale di ciascuna colonna devono essere scartati.
NOTA: A questo punto, ogni pozzetto dovrebbe contenere 50 μl di DMEM misto e diluizioni seriali di sieri di pazienti o sieri di controllo.
- Centrifugare la piastra per 1 minuto a 500 giri/min per garantire che non rimanga liquido sulle pareti del pozzetto.
- Utilizzando i dati ottenuti tramite titolazione dello pseudotipo, calcolare la quantità di DMEM necessaria per diluire il PV SARS-CoV-2 per ottenere 5 x 106 RLU in 50 μl, con un volume totale di 5 ml.
- Miscelare questa soluzione PV diluita in una vaschetta per pipette utilizzando la pipetta multicanale e aliquotare 50 μl in ciascun pozzetto della piastra, ad eccezione dei pozzetti A6-A12 (controllo solo cella). A1-A6 servirà come controllo solo fotovoltaico.
- Centrifugare la piastra per 1 minuto a 500 giri/min per garantire che nessun virus rimanga sulle pareti del pozzetto.
- Incubare le piastre per 1 ora a 37 °C 5% di anidride carbonica (CO2), lasciando che il siero si leghi alla glicoproteina SARS-CoV-2.
- Preparare una piastra di cellule bersaglio HEK 293T/17 trasfettate 24 ore prima con plasmidi di espressione dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) e plasmidi di espressione transmembrana della serina proteasi 2 (TMPRSS2).
- Rimuovere i terreni di coltura dalla piastra.
- Lavare la piastra due volte con 2 ml di PBS su un lato della piastra per evitare il distacco delle cellule e scartarla.
- Aggiungere 2 ml di tripsina alla piastra e mettere la piastra nell'incubatrice fino a quando le cellule non si sono staccate.
- Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere 6 ml di DMEM/10% FBS/1% penicillina/streptomicina alla piastra per estinguere l'attività della tripsina e risospendere delicatamente le cellule.
- Contare le cellule utilizzando il contatore di celle automatizzato TC20TM o il vetrino della camera di conteggio e aggiungere 1 x 104 celle in un volume totale di 50 μl a ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra per 48-72 h, a 37 °C, 5% CO2.
- Leggere la piastra utilizzando il sistema di dosaggio della luciferasi Bright GloTM su un luminometro per micropiastre GloMax® Navigator, rimuovendo il terreno di coltura da tutti i pozzetti e aggiungendo 25 μl di una miscela 1:1 di PBS: reagente per il saggio della luciferasi Bright GloTM
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- Dai dati grezzi forniti dal luminometro, calcolare la concentrazione inibitoria semimassima (IC50) che neutralizza i titoli anticorpali utilizzando i protocolli stabiliti. I valori di IC50 inferiori alla diluizione 1:40 sono considerati negativi. In alternativa, i dati possono essere valutati utilizzando AutoPlate.