Saggi per la valutazione qualitativa e quantitativa delle concentrazioni di glucosio nelle urine di topo

Abstract

Questo video mostra una procedura per raccogliere l'urina del topo e valutarne i livelli di glucosio. Per valutare il livello di glucosio, immergere nel campione una striscia reattiva rivestita con enzimi e un colorante cromogenico, avviando un cambiamento di colore che indica i livelli di glucosio. Per quantificare i livelli di glucosio nelle urine, introdurre un campione di urina in una piastra multipozzetto con concentrazioni di glucosio crescenti, aggiungere la miscela di reazione e incubare. Misurare l'assorbanza per creare una curva standard e calcolare i livelli di glucosio in base all'assorbanza del campione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Test della glicemia nelle urine spot

1. Posiziona un pezzo di Parafilm pulito su una superficie piana.
2. Prendi delicatamente un topo per la coda e posizionalo sul Parafilm.
3. Trattenere il mouse per la collottola usando il pollice e l'indice. Solleva delicatamente il topo mentre sei trattenuto dalla collottola, provocando la minzione del topo come risposta allo stress. Lasciare che una goccia di urina cada sulla superficie del parafilm. Rimetti il topo nella sua gabbia dopo aver raccolto la goccia di urina.
4. Immergere l'estremità del reagente di una striscia di Diastix nella goccia di urina fresca raccolta sulla superficie del Parafilm. Rimuovere immediatamente la striscia e adagiarla su una superficie con il lato colorato rivolto verso l'alto. Attendi almeno 30 secondi affinché si sviluppi completamente un colore sulla striscia. Confrontare il colore sviluppato con la tabella di riferimento fornita sul contenitore Diastix (Figura 1).
   Suggerimenti: Se il topo non urina sul Parafilm, applicare una leggera pressione sul basso addome del topo (intorno alla vescica urinaria) usando il dito indice. Questo approccio aiuterà a rilasciare gocce di urina sul parafilm. Per i topi che non urinano dopo aver seguito la procedura sopra descritta, attendere 20 minuti e ricominciare la procedura. Assicurarsi che tutte le procedure vengano eseguite nel rispetto delle linee guida IACUC.

2. Raccolta delle urine delle 24 ore utilizzando una gabbia metabolica per topi

1. Assemblare una gabbia metabolica Tecniplast (Figura 2) secondo le istruzioni del produttore.
2. Riempire il gruppo di alimentazione con cibo in polvere e quindi fissare il gruppo di alimentazione alla linguetta metallica appropriata sulla camera superiore.
3. Fissare il supporto della bottiglia d'acqua sulla linguetta metallica rimanente sulla camera superiore.
4. Riempi la bottiglia d'acqua vuota e poi infilala nel supporto della bottiglia, assicurandoti che il tubo del sorseggiatore sia nel foro.
5. Metti un topo nella gabbia metabolica e poi coprilo con un coperchio.
6. Assicurarsi che il coperchio della gabbia sia montato correttamente.
7. Posizionare una provetta per la raccolta delle urine e una provetta per la raccolta delle feci nei punti appropriati sul pavimento inferiore della camera.
8. Dopo 24 ore, recuperare la provetta di raccolta delle urine ed eseguire un test del glucosio per determinare la concentrazione di glucosio nelle urine. Se il dosaggio del glucosio non viene eseguito lo stesso giorno, congelare il campione di urina nel congelatore a -80°C.

3. Determinazione della concentrazione di glucosio nelle urine nelle 24 ore

1. Se il campione di urina viene conservato a -80°C, lasciarlo scongelare prima di eseguire un test del glucosio.
2. Da 100 mg/dl, preparare otto standard che vanno da 25 mg/dl a 0 mg/dl secondo le indicazioni del kit di analisi.
3. Preparare i pozzetti standard e i pozzetti dei campioni di urina in una piastra da 96 pozzetti, tutti in duplicati, secondo il manuale del kit.
4. Dopo aver avviato la reazione aggiungendo la quantità raccomandata di miscela enzimatica a tutti i pozzetti, coprire la piastra e lasciarla incubare per 10 minuti a 37°C.
5. Lettura dell'assorbanza a 500-520 nm utilizzando un lettore di piastre.
6. Analizzare i dati secondo le istruzioni del kit di analisi. Traccia l'assorbanza di ogni standard rispetto alla concentrazione di glucosio e utilizza il grafico per determinare la concentrazione di glucosio del campione di urina delle 24 ore.

Risultati

Figura 1. Test della glicemia nelle urine. Le gocce di urina di topo raccolte su Parafilm e la tabella di riferimento dei colori fornita sul contenitore di Diastix.

Figura 2. Gabbia metabolica Tecniplast per la raccolta delle urine di topo 24 o...