Isolamento di cellule T Natural Killer invarianti da un modello murino

Abstract

Fonte: Meng, M., et al. Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT nei topi RA indotti da glucosio-6-fosfato isomerasi (G6PI).J. Vis. Exp.(2020)

Questo video illustra un metodo per isolare le cellule T natural killer invarianti, note anche come cellule iNKT. La procedura inizia con l'iniezione di un glicolipide sintetico in un topo per stimolare l'attivazione e la proliferazione delle cellule iNKT nella milza. Successivamente, le sospensioni di singole cellule vengono preparate dalla milza e incubate con complessi di riconoscimento delle cellule iNKT marcati con fluorofori, seguite da una separazione basata su biglie magnetiche, per isolare le cellule iNKT.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Ottenere cellule T natural killer invarianti (cellule iNKT) con la terapia cellulare adottiva

1. Induzione direzionale di cellule iNKT
   1. Iniettare topi normali per via intraperitoneale con α-Galattosilceramide (α-GalCer) (0,1 mg/kg di peso corporeo).
2. Isolamento delle cellule iNKT
   1. Tre giorni dopo la modellazione, iniettare nei topi per via intraperitoneale pentobarbital sodico all'1% (50 mg/kg di peso corporeo) per l'anestesia. I topi adeguatamente anestetizzati non mostrano una risposta di ritiro della zampa posteriore a un pizzico del dito del piede.
   2. Isolare la milza di un topo DBA/1 dopo averla iniettata per via intraperitoneale con α-GalCer. Preparare una sospensione unicellulare tagliando e macinando la milza in un setaccio da 200 maglie.
   3. Lavare la sospensione cellulare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS), centrifugare a 200 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Ripetere.
   4. Risospendere le cellule con 1 mL di sangue intero e soluzione di diluizione tissutale. Aggiungere 3 mL di terreno di separazione dei linfociti di topo, quindi centrifugare le cellule per 20 minuti a 300 x g a temperatura ambiente.
   5. Raccogli lo strato di linfociti bianchi lattiginosi (cioè il secondo strato dall'alto), lavalo 2 volte con PBS e conta con un contatore di cellule automatizzato.
3. Strategia di selezione positiva di selezione magnetica attivata da cellule (MACS) per la purificazione di cellule iNKT
   nota: Per il pretrattamento dei tetrameri CD1d, 1 mg/mL di α-Galcer è stato diluito a 200 μg/mL con lo 0,5% di Tween-20 e lo 0,9% di NaCl, e 5 μL della soluzione risultante sono stati aggiunti a 100 μL della soluzione di tetramero CD1d. La miscela è stata incubata per 12 ore a temperatura ambiente e posta a 4 °C per l'uso. Il recettore delle cellule T (TCR) β è stato diluito 80 volte con acqua deionizzata. Tutti gli altri anticorpi sono stati utilizzati come soluzione stock.
   1. Risospendere 10⁷ cellule con 100 μL di PBS a 4 °C, aggiungere 10 μL di CD1d Tetramero-ficoeritrina caricato con α-GalCer (CD1d Tetramer-PE) e incubarle a 4 °C per 15 minuti al buio.
   2. Lavare le cellule 2 volte con PBS e risospenderle in 80 μL di PBS.
   3. Aggiungere 20 μL di anti-PE-MicroBeads e incubarle a 4 °C per 20 minuti al buio.
   4. Lavarli 2 volte con PBS e risospendere le cellule con 500 μL di PBS.
   5. Posizionare la colonna di cernita nel campo magnetico dello smistatore MACS e risciacquare con 500 μL di PBS.
   6. Aggiungere la sospensione cellulare del passaggio 1.3.4 alla colonna di smistamento, raccogliere il flusso e risciacquare 3 volte con tampone PBS.
   7. Rimuovere il campo magnetico e raccogliere le celle dalla colonna di smistamento. A questo punto, aggiungere 1 mL di tampone PBS alla colonna di smistamento e spingere rapidamente lo stantuffo a una pressione costante per guidare le cellule marcate verso la provetta di raccolta e ottenere cellule iNKT purificate. Conta con un contatore di celle automatizzato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microsfere anti-PE	Miltenyi	Codice 130-048-801	Germania
Colonne	Miltenyi	ms	Germania
Centrifuga criogenica	Beckman	Allegra® X-15R	America
Topo CD1d Tetramero-PE	Alessio	TS-MCD-1	Giappone
Percoll del mouse	Distretto di Solarbio	P8620	Cina
Microscopio ottico	Olimpo	Olimpo-II	Giappone