Miglioramento della trasduzione virale nelle cellule natural killer utilizzando un polimero cationico

Abstract

Fonte: Nanbakhsh, A., et al. destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale delle cellule NK primarie murine e umane. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra un test per la trasduzione virale mediata da polimeri cationici in cellule natural killer (NK). Le cellule sono incubate con vettori di lentivirus transgenici che codificano per una proteina fluorescente. L'aggiunta di un polimero cationico consente al virus di attaccarsi alle cellule e integrare il suo RNA nel genoma ospite, esprimendo la proteina fluorescente. La fluorescenza viene quantificata per valutare l'aumento della trasduzione indotto dal polimero.

Protocollo

1. Trasduzione di cellule NK primarie murine e umane con lentivirus

1. Sospendere le cellule NK primarie di topo o umane in una piastra a 24 pozzetti a 0,5 × 10⁵/mL di terreno in presenza di surnatante lentivirale della proteina fluorescente verde (GFP) a 5, 10 e 20 molteplicità di infezione (MOI) e in presenza di Pb (8 μg/mL), PS (8 μg/mL) o destrano (8 μg/mL).
2. Centrifugare le piastre a 1.000 × g per 60 min.
3. Senza decantare il surnatante, coltivare le cellule per una notte (16-18 ore) in un incubatore a 37 °C infuso con CO₂ al 5,2%.
4. Lavare con 10 mL di PBS e risospendere in 2 mL di terreno di coltura completo del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 in presenza di interleuchina 2 (IL-2, 300 U/mL).
5. Raccogli le cellule NK trasdotte il giorno 7 picchiettando delicatamente le fiasche.
   1. Attivare le cellule raccolte con concentrazioni titolate di mAb anti-natural killer di gruppo 2D (NKG2D) (A10) legato a piastre rivestendo piastre di polistirene altamente assorbenti a 96 pozzetti con concentrazioni di 2,5 μg/mL di anticorpi monoclonali anti-NKG2D durante la notte.
   2. Lavare ogni pozzetto con 100 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tre volte prima dell'aggiunta di cellule NK primarie.
6. Raccogliere i surnatanti di coltura utilizzando una pipetta multicanale tra le 16 e le 18 ore dopo l'attivazione per quantificare citochine come l'interferone-gamma (IFN-γ). Generare curve standard utilizzando le citochine ricombinanti fornite con i kit ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
7. Testare la vitalità delle cellule NK utilizzando la colorazione con annessina-V/7-ammino-actinomicina D (7-AAD) e determinare la percentuale di cellule necrotiche tra le cellule NK trasformate utilizzando un citometro a flusso.
   1. Per eseguire questo test, raccogliere le cellule NK murine e umane quattro giorni dopo la trasduzione, lavare due volte con 10 mL di PBS freddo a 500 × g per 5 minuti ciascuna e incubare con un kit di Annexin-V (PE)/7-AAD.
8. Utilizzare un software di citometria a flusso appropriato per analizzare i dati. Selezionare la popolazione di cellule vive e analizzare l'espressione della GFP (canale dell'isotiocianato di fluoresceina [FITC]) come misura della trasduzione virale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Destrano	Sigma-Aldrich	90-64-91-9
Polibrene (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
Protamina solfato (PS)	Sigma-Aldrich	p3369
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Interferone gamma (IFN-γ )	eBioscience	Codice 14-7311-85
Soluzione colorante per loduro di propidio	Bd	51-66211E
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher	L3000015
Isoflurano	fenice	NDC 57319-559-05
Celle 293T	ATCC	Codice CRL-3216
Palloni T75	Corning	Codice 430641U
Kit ELISA	Ebioscienze	00-4201-56