Trasfezione di macrofagi primari con mRNA modificato

Abstract

Fonte: Herb, M. et al., Trasfezione altamente efficiente di macrofagi primari con mRNA trascritto in vitro. (2019)

Questo video mostra il processo di trasfezione dei macrofagi primari con mRNA modificato che codifica per la proteina fluorescente verde. Questi mRNA modificati, progettati per ridurre l'immunogenicità e migliorarne la stabilità, garantiscono la trasfezione di successo e la successiva espressione di proteine fluorescenti verdi, confermata dalla microscopia a fluorescenza.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

NOTA: Esegui tutti i passaggi indossando i guanti. Eseguire tutte le fasi di trasfezione sotto una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione delle cellule. Prima di lavorare con l'mRNA, pulire tutti gli strumenti come le pipette e ogni superficie con etanolo al 70% e/o un tensioattivo che degrada l'RNAsi (Tabella dei materiali). Assicurarsi che tutte le provette di reazione siano prive di RNAsi e sterili. Utilizzare solo acqua sterile priva di RNAasi per le diluizioni. Utilizzare esclusivamente puntali per pipette con filtri. Sostituire i puntali delle pipette dopo ogni fase di pipettaggio.

1. Generazione del modello di DNA

NOTA: Il modello di DNA per la trascrizione dell'mRNA in vitro utilizzando questo protocollo deve contenere una sequenza promotrice T7 per consentire l'aggancio dell'RNA polimerasi. Se il plasmide contenente la sequenza di DNA della proteina di interesse contiene già una sequenza promotrice T7 correttamente orientata direttamente a monte della sequenza di interesse, è necessario eseguire la linearizzazione del plasmide (vedi passaggio 1.1.). In caso contrario, collegare un promotore T7 alla sequenza di interesse mediante reazione a catena della polimerasi (PCR, vedere passaggio 1.2.).

1. Linearizzazione di plasmidi contenenti promotori T7
   1. Linearizzare plasmidi già contenenti una sequenza promotrice T7 correttamente orientata mediante digestione con un enzima di restrizione che taglia a valle del codone di stop della sequenza di interesse. In caso contrario, la trascrizione non terminerà correttamente dopo la sequenza di interesse.
      NOTA: È meglio usare enzimi di restrizione lasciando estremità smussate o sporgenze di 5'.
   2. Confermare la linearizzazione completa del plasmide mediante elettroforesi su gel di agarosio del DNA plasmidico non digerito rispetto a quello digerito.
   3. Purificare il DNA plasmidico linearizzato prima dell'uso come modello di DNA per la trascrizione dell'mRNA in vitro utilizzando un kit di purificazione del DNA (Tabella dei materiali).
2. Fissaggio del promotore T7 mediante PCR
   1. Utilizzare un primer in avanti contenente i seguenti componenti (nell'ordine indicato da 5' a 3'): circa 5 bp casuali a monte del promotore (ad esempio, GAAAT); la sequenza promotrice T7 (TAATACGACTCACTATAG); due G extra per aumentare l'efficienza di trascrizione (GG); la parte specifica della sequenza bersaglio che è omologa alla sequenza plasmidica che circonda il codone di inizio.
      nota: Dovrebbe essere composto da 3-6 bp a monte della sequenza di KOZAK e del codone di inizio, della sequenza di KOZAK e del codone di inizio (solitamente GCCACC ATG G), 12-18 bp a valle del codone di inizio. Se la sequenza di interesse non contiene già una sequenza KOZAK o un codone di inizio, questi possono essere attaccati in questa fase semplicemente includendoli nella sequenza di base.
   2. Calcolare la t_m del primer diretto solo tenendo conto della parte omologa alla sequenza target.
   3. Per valutare la formazione di dimeri/forcine utilizzare l'intera sequenza di primer, che può facilmente superare i 50 bp.
   4. Utilizzare un innesco inverso situato da qualche parte a valle del codon.
      NOTA: Se la sequenza di interesse non contiene già un codone di stop, può essere attaccato in questo passaggio semplicemente includendolo nella sequenza di primer.
   5. Utilizzare i primer diretti e inversi per eseguire una PCR utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà con correzione di bozze (Tabella dei materiali).
   6. Confermare la generazione di un singolo prodotto e la dimensione dell'amplicone mediante elettroforesi su gel di agarosio (ad esempio, utilizzare un gel di agarosio all'1% e una corrente costante di 100 V).
   7. Purificare il prodotto PCR prima dell'uso come stampo dell'acido desossiribonucleico (DNA) per la trascrizione in vitro dell'acido ribonucleico messaggero (mRNA) utilizzando un kit di purificazione del DNA.

2. Generazione di mRNA

1. Scongelare tutti i componenti del kit di trascrizione dell'mRNA in vitro (vedere la Tabella dei materiali). Vortice per 5 s e centrifuga per 2 s a 2.000 x g. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. Preparare la miscela di reazione per la trascrizione in vitro dell'mRNA in una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL nel seguente ordine (volume totale di 40 μL): 20 μL di miscela 10x analoghi anti-reverse cap/nucleoside trifosfato (ARCA/NTP) (inclusa nel kit di trascrizione dell'mRNA in vitro); 0,25 μL di 5-metil-citidina trifosfato (5-mCTP) (la concentrazione finale (f.c.) è 1,25 mM; 50% del CTP totale); 0,25 μL di pseudo-uridina trifosfato (pseudo-UTP) (f.c. è 1,25 millimetro; 50% del totale degli UTP); X μL di modello di DNA; 2 μL di miscela di RNA polimerasi T7 (inclusa nel kit di trascrizione dell'mRNA in vitro); Y μL di H₂O. libero da RNAsi
   NOTA: X è un volume contenente almeno 1 μg di DNA. Ad esempio, 1,6 μL da una soluzione madre da 625 ng/μL. Y è il volume di riserva per il volume totale di 40 μl.
3. Vortice per 5 s e centrifuga per 2 s a 2.000 x g. Incubare a 37 °C per 30 minuti a 400 giri/min su un mixer termico per trascrizione in vitro.
4. Quindi, aggiungere 2 μL di DNasi I direttamente nella miscela di reazione per la rimozione del DNA stampo. Vortice per 5 s e centrifuga per 2 s a 2.000 x g.
5. Incubare a 37 °C per 15 minuti a 400 giri/min su un miscelatore termico. Prelevare un'aliquota di 2 μl per il gel di controllo (fase 3.3) e conservare a -80 °C.
6. Per la coda di poli(A), aggiungere i seguenti componenti direttamente nella precedente miscela di reazione (fino a un volume finale di 50 μL): 5 μL di tampone di reazione 10x poli(A) polimerasi e 5 μL di poli(A) polimerasi (entrambi inclusi nel kit di trascrizione dell'mRNA in vitro). Vortice per 5 s e centrifuga per 2 s a 2.000 x g.
7. Incubare la miscela a 37 °C per 30 minuti a 400 giri/min su un termomiscelatore. Prelevare un'aliquota di 2 μl per il gel di controllo (fase 3.3) e conservare a -80 °C.
8. Per la defosforilazione delle estremità 5' dell'mRNA, aggiungere i seguenti componenti direttamente nella precedente miscela di reazione (fino a un volume finale di 60 μL): 3 μL di H₂O privo di RNAsi; 6 μL di tampone di reazione 10x Antarctic phosphatasi; 3 μL di Antarctic phosphatasi (15 unità per 60 μL di volume di reazione). Vortice per 5 s e centrifuga per 2 s a 2.000 x g.
9. Incubare la miscela a 37 °C per 30 minuti a 400 giri/min su un miscelatore termico.
10. Inattivare termicamente la fosfatasi antartica mediante incubazione a 80 °C per 2 min.
    nota: Idealmente, utilizzare un miscelatore termico separato, non attendere che il primo miscelatore raggiunga la temperatura desiderata.

3. Purificazione dell'mRNA

1. Purificare l'mRNA trascritto in vitro utilizzando un kit di purificazione dell'RNA dedicato (Tabella dei materiali).
   1. Aggiungere X μL di soluzione di eluizione alla miscela di reazione dell'mRNA dal passaggio 2.10. Mescolare capovolgendo 5 volte. Aggiungere 300 μl di concentrato di soluzione legante. Miscelare mediante pipettaggio delicato 5 volte.
      NOTA: X è il volume di riserva per un volume totale di 100 μl. Ad esempio, aggiungere una soluzione di eluizione da 40 μl a una miscela di reazione dell'mRNA da 60 μl.
   2. Aggiungere 100 μl di etanolo privo di RNAasi. Miscelare mediante pipettaggio delicato 5 volte.
   3. Posizionare una colonna filtrante in una delle provette di raccolta in dotazione. Trasferire delicatamente la miscela di reazione dell'mRNA al centro del filtro senza toccare il filtro. Centrifugare a 15.000 x g per 1 min a temperatura ambiente (RT).
   4. Sollevare con cautela la colonna del filtro ed eliminare il flusso nel tubo di raccolta. Riposizionare la colonna filtrante nella stessa provetta di raccolta.
   5. Aggiungere 500 μL di soluzione di lavaggio (non dimenticare di aggiungere 20 mL di etanolo privo di RNAasi prima di utilizzare la soluzione di lavaggio per la prima volta).
   6. Centrifugare a 15.000 x g per 1 minuto a RT. Ripetere i passaggi 3.1.4-3.1.6 per lavare ancora una volta.
   7. Centrifugare alla massima velocità (17.900 x g) per 1 min a RT per rimuovere eventuali residui di fluido dalla colonna filtrante. Estrarre con cautela la colonna filtrante dal tubo di raccolta. Posizionare la colonna filtrante in una nuova provetta di raccolta.
   8. Aggiungere 50 μl di tampone di eluizione al centro del filtro senza toccare il filtro. Incubare a 65 °C per 10 minuti su un miscelatore termico.
   9. Centrifugare a 15.000 x g per 1 minuto a RT. Rimuovere la colonna filtrante e gettarla.
2. Misurare la concentrazione e la purezza dell'mRNA eluito, ad esempio, utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi per misurare l'assorbanza a 260 e 280 nm.
   NOTA: Un rapporto A260/A280 di 1,8-2,1 è indicativo di mRNA altamente purificato.
3. Verificare la presenza di un singolo prodotto, la corretta lunghezza del trascritto e la coda di poli(A) analizzando le aliquote delle fasi 2.5 e 2.7 mediante elettroforesi su gel di agarosio in condizioni di denaturazione (ad esempio, utilizzare un gel di agarosio all'1,2% contenente 20 mM di acido 3-(N-morfolino)propansulfonico [MOPS], 5 mM di acetato di sodio, 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 20% di formaldeide ed eseguire l'esecuzione in 20 mM di MOPS, 5 mM di acetato di sodio, 1 mM di EDTA e 0,74 % di formaldeide a 100 V di corrente costante).
4. Conservare l'mRNA purificato nella provetta di eluizione a -80 °C fino alla trasfezione. Se si utilizzano solo basse quantità di mRNA per la trasfezione, aliquotare l'mRNA per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
   NOTA: l'mRNA può essere conservato a -80 °C per circa 1 anno.

4. Preparazione dei Macrofagi

1. Eutanasia di topi C57/BL6 (utilizzare topi dello stesso sesso e di età compresa tra 6 e 24 settimane) mediante lussazione cervicale.
   NOTA: Gli stessi topi possono essere utilizzati per l'isolamento dei macrofagi primari (PM) (passaggio 4.2) e la generazione di BMDM (passaggi 4.3 e 4.4). Per l'isolamento del PM utilizzare almeno due topi. Se si deve generare solo BMDM, un mouse di solito è sufficiente.
2. Arricchimento immunomagnetico dei macrofagi peritoneali.
   1. Riempire una siringa da 10 ml con una cannula da 0,9 x 40 mm con 8 ml di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) e 2 ml di aria. Lavare la cavità peritoneale con PBS. L'aria formerà una bolla che riduce al minimo la perdita del PBS.
   2. Raccogliere rapidamente il lavaggio peritoneale con la stessa siringa e trasferirlo in una provetta da centrifugazione conica da 50 mL. Se necessario, combinare le cellule peritoneali di più topi. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
   3. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di NaCl allo 0,2 % per 30 s per lisare i globuli rossi.
   4. Aggiungere 5 mL di NaCl all'1,6% a un volume totale di 10 mL per ricostituire le condizioni isotoniche. Centrifugare a 650 x g per 5 min a 4 °C.
   5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 97,5 μL di tampone di selezione cellulare magnetica (MCS) (2 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA], 0,5% di albumina sierica bovina [BSA] in PBS) per 1 lavaggio peritoneale (ad esempio, se tre topi sono stati lavati, risospendere in 292,5 μL).
   6. Aggiungere 2,5 μl di microsfere paramagnetiche coniugate a un anticorpo specifico per CD11b per 97,5 μl di sospensione cellulare (ad esempio, aggiungere 7,5 μl a 292,5 μl).
   7. Incubare su ghiaccio per 15 minuti a 150 giri/min su un agitatore orbitale.
   8. Centrifugare la sospensione della cella a 650 x g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet della cella in 1 mL di tampone MCS.
   9. Aggiungere 4 mL di tampone MCS a un volume totale di 5 mL e lavare le cellule pipettando delicatamente su e giù tre volte.
   10. Ripetere i passaggi 4.2.8 e 4.2.9 altre due volte per un totale di tre fasi di lavaggio.
   11. Durante le fasi di lavaggio, posizionare una colonna LS in un separatore di celle magnetiche (vedi Tabella dei materiali). Sciacquare la colonna con 3 mL di tampone MCS.
       nota: Evitare eventuali bolle in quanto potrebbero ostruire la colonna.
   12. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone MCS. Aggiungere 3 mL di tampone MCS a un volume totale di 4 mL e miscelare pipettando su e giù tre volte.
   13. Trasferire i 4 mL di sospensione cellulare sulla colonna LS risciacquata.
       NOTA: Ancora una volta, evitare eventuali bolle in quanto potrebbero ostruire la colonna.
   14. Attendere che il serbatoio della colonna sia completamente vuoto. Non aggiungere altro liquido fino a quando la colonna non smette di gocciolare.
   15. Aggiungere 3 mL di tampone MCS alla colonna. Quindi, attendere che il serbatoio della colonna sia completamente vuoto. Ripetere il passaggio 4.2.15 altre due volte.
   16. Posizionare la colonna LS in una provetta da centrifugazione conica da 15 mL. Applicare 5 mL di tampone MCS sulla colonna. Attendere che 2 mL di fluido siano passati attraverso la colonna, quindi utilizzare lo stantuffo per spingere delicatamente la frazione rimanente nella provetta.
   17. Centrifugare la sospensione in cella a 650 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   18. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) inattivato termicamente (DMEM+FCS).
   19. Determinare il numero di cellule vitali contando in soluzione di blu di tripano in una camera di conteggio Neubauer e seminare le cellule in DMEM+FCS in piastre di coltura.
       NOTA: Seminare il PM a una densità di 100.000 cellule/pozzetto in una piastra di microtitolazione a fondo piatto. Non utilizzare piastre trattate con coltura tissutale poiché il PM non può essere staccato da esse. Utilizzare invece piastre non trattate.
3. Generazione di BMDM
   1. Rimuovere la pelle e i muscoli dalle zampe posteriori usando un paio di forbici. Lavare ogni gamba mediante breve immersione in etanolo al 70%.
   2. Staccare le zampe e aprire entrambe le estremità del femore e della tibia tagliando con le forbici.
   3. Riempire una siringa da 5 mL riempita con una cannula da 0,6 mm x 30 mm con 5 mL di RPMI 1640 a bassissima endotossina (VLE) e lavare il midollo osseo dalle ossa aperte in un piatto di coltura.
   4. Se necessario, combinare il midollo osseo di più topi ripetendo i passaggi 4.3.1-4.3.3. Trasferire il midollo osseo in una provetta da centrifugazione conica da 50 mL.
   5. Centrifugare la sospensione di midollo osseo a 650 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   6. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (8,3% di cloruro di ammonio, NH₄Cl, 0,1 M Tris) e incubare per 5 minuti a RT per lisare i globuli rossi.
   7. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g a 4°C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
   8. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 integrato con il 10% di FCS, l'1% di penicillina/streptomicina, l'1% di HEPES, l'1% di piruvato di sodio e 10 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi ricombinanti (M-CSF) (RPMI+++++).
   9. Aggiungere 4 mL di RPMI+++++ per un volume totale di 5 mL.
   10. Preparare 5 piastre di Petri non trattate da 92 mm x 16 mm con camme (vedere Tabella dei materiali) per topo pipettando 7 mL di terreno RPMI+++++ in ciascuna piastra.
   11. Trasferire 1 mL di soluzione cellulare nelle 5 piastre di coltura preparate e incubare a 37 °C e 5% di CO₂.
   12. Dopo 4 giorni, nutrire le cellule aggiungendo 4 ml di RPMI+++++. Dopo 6-7 giorni, le cellule del midollo osseo sono completamente differenziate in BMDM.
4. Raccolta di BMDM
   1. Rimuovere completamente il terreno dai piatti di coltura. Aggiungere 5 ml di EDTA caldo 0,2 mM in PBS a ciascun piatto.
   2. Raschiare delicatamente l'intera piastra con un raschietto per celle per staccare il BMDM. Combinare le sospensioni cellulari in una provetta da centrifugazione conica da 50 mL.
   3. Sciacquare di nuovo tutti e 5 i piatti. Utilizzare lo stesso volume di 5 mL di EDTA caldo da 0,2 mM in PBS per tutte e 5 le stoviglie. Combina questa sospensione a celle con quella del passaggio precedente.
   4. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g per 5 minuti a 4°C ed eliminare il surnatante.
   5. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno VLE RPMI 1640 integrato con FCS al 10%, HEPES all'1%, piruvato di sodio all'1% e M-CSF ricombinante a 10 ng/mL ma senza antibiotici (RPMI⁺⁺⁺⁺).
   6. Determinare il numero di cellule vitali contando in soluzione di blu di tripano in una camera di conteggio Neubauer e seminare le cellule in RPMI⁺⁺⁺⁺ in piastre di coltura.
      nota: Seminare BMDM ad una densità di 50.000 cellule/pozzetto massimo in una piastra di microtitolazione a fondo piatto. Non utilizzare piastre trattate con coltura tissutale poiché il BMDM difficilmente può essere staccato da queste. Utilizzare invece piastre non trattate.

5. Trasfezione di macrofagi con mRNA

1. Calcolare il volume richiesto del tampone di trasfezione dell'mRNA.
   nota: Il volume del tampone di trasfezione dell'mRNA richiesto dipende dalle dimensioni del pozzetto: utilizzare 200 μL per la trasfezione in una piastra a 6 pozzetti, 100 μL in una piastra a 12 pozzetti e così via. Aggiungere sempre un po' di volume di riserva a causa della perdita di pipettaggio (ma non troppo, per evitare un'indebita diluizione dell'mRNA). Ad esempio, utilizzare 450 μL invece di 4 x 100 μL = 400 μL per trasfettare in 4 pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.
2. Calcolare il volume richiesto del reagente di trasfezione dell'mRNA. Il reagente di trasfezione dell'mRNA viene aggiunto con un rapporto di 1:50. Ad esempio, sono necessari 9 μL di reagente di trasfezione dell'mRNA per un volume finale di 450 μL.
3. Calcola la quantità totale di mRNA richiesta. Per una trasfezione efficiente sono necessari almeno 100 ng per 100.000 macrofagi, 200 ng funzionano ancora meglio (ad esempio, 800 ng di mRNA per trasfettare 400.000 macrofagi).
   1. Moltiplicare la quantità calcolata di mRNA necessaria per il numero totale di pozzetti che devono essere trasfettati (ad esempio, 4 pozzetti con 400.000 macrofagi ciascuno: 4 x 800 ng = 3.200 ng di mRNA sono necessari in totale per tutti i pozzetti). Ad esempio, se lo stock di mRNA è di 426,8 ng/μL, sono necessari 7,49 μL per la trasfezione ottimale di 4 pozzetti con 400.000 macrofagi ciascuno.
4. Aggiungere il volume calcolato del tampone di trasfezione dell'mRNA (passaggio 5.1.) meno i volumi del reagente di trasfezione dell'mRNA (passaggio 5.2) e dell'mRNA (passaggio 5.3) in una provetta di reazione. Ad esempio, 450 μl - 9 μl - 7,49 μl = 433,51 μl.
5. Scongelare lo stock di mRNA e mescolarlo ruotando delicatamente il tubo di eluizione. Aggiungere il volume calcolato di mRNA (passaggio 5.3) alla provetta di reazione con tampone di reazione a mRNA (nell'esempio presentato sopra: 7,49 μL in 433,51 μL).
6. Vortice per 5 s e centrifuga per 2 s a 2.000 x g.
7. Agitare il reagente di trasfezione dell'mRNA per 5 s e centrifugare per 2 s a 2.000 x g.
8. Aggiungere il volume calcolato del reagente di trasfezione dell'mRNA (passaggio 5.2) alla provetta di reazione contenente il tampone di trasfezione dell'mRNA e l'mRNA (nell'esempio presentato sopra: 9 μL di reagente di trasfezione dell'mRNA).
9. Agitare la miscela di trasfezione per 5 s e centrifugare per 2 s a 2.000 x g.
10. Incubare per 15 minuti a RT.
11. Nel frattempo, sostituire il terreno di coltura dei macrofagi con un terreno di coltura fresco e caldo (vedere i passaggi 4.2.18 e 4.4.5).
12. Dopo la fase di incubazione 5.10, aggiungere la miscela di trasfezione ai pozzetti contenenti i macrofagi in un volume appropriato alle dimensioni del pozzetto (vedere passaggio 5.1). Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia in un cerchio dall'esterno al centro del pozzo.
13. Agitare delicatamente la piastra, prima in verticale e poi in direzione orizzontale per garantire una distribuzione uniforme della miscela di trasfezione nel pozzetto. Quindi, incubare a 37 °C e 5 % di CO₂. La sintesi della proteina codificata dall'mRNA trasfettato inizierà poco dopo la trasfezione. Per ottenere i migliori risultati, incubare per almeno 6 ore.
14. Dopo l'incubazione, analizzare l'efficienza della trasfezione mediante microscopia a (immuno)fluorescenza, citometria a flusso o immunoblot, oppure utilizzare i macrofagi trasfettati per l'esperimento di scelta.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-metil-CTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1138S	conservato a -20 °C
Fosfatasi antartica	Biolaboratori del New England	Codice: M0289	conservato a -20 °C
Tampone di reazione alla fosfatasi antartica (10X)	Biolaboratori del New England	B0289	conservato a -20 °C
anticorpo anti-NEMO/IKKγ	Invitrogen	MA1-41046	conservato a -20 °C
anticorpo anti-β-actina	Sigma-Aldrich	Codice: A2228	conservato a -20 °C
Piastre di Petri 92,16 mm con camme	Sarstedt	8.21.473	memorizzato presso RT
CD11b Microbeads topo e umano	Miltenyi Biotec	Codice 130-049-601	conservato a 4 °C
Cre ricombinasi + primer in avanti T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3', conservato a -20 °C
Cre ricombinasi + primer inverso T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, conservato a -20 °C
Kit di purificazione del DNA: Kit di purificazione QIAquick PCR	Qiagen	Codice 28104	memorizzato presso RT
Primer in avanti eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3', conservato a -20 °C
Primer inverso eGFP + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5'-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3', conservato a -20 °C
Buffer di digestione rapida (10X)	Termo Scientifico	B64	conservato a -20 °C
FastDigest XbaI	Termo Scientifico	FD0684	conservato a -20 °C
Polimerasi ad alta fedeltà con correzione di bozze: Q5 DNA-polimerasi ad alta fedeltà	Nuova Inghilterra Biolabs Inc	Codice: M0491S	conservato a -20 °C
IKKβ + T7-Promotor primer in avanti	Sigma-Aldrich		5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, conservato a -20 °C
Innesco inverso IKKβ + T7-Promotor	Sigma-Aldrich		5′-GAGGAAGCGAGCT-CCATCTG-3′, conservato a -20 °C
kit di trascrizione dell'mRNA in vitro: kit di mRNA HiScribe T7 ARCA (con coda polyA)	Biolaboratori del New England	E2060	conservato a -20 °C
Colonne LS	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-401	memorizzato presso RT
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-303	memorizzato presso RT
Tampone e reagente per trasfezione dell'mRNA: jetMESSENGER	Trasfezione Polyplus	409-0001DE	conservato a 4 °C
Plasmide mutante IKKβ IKK-2S177/181E	Addgene	Codice: 11105	conservato a -20 °C
Plasmide mutante NEMOC54/347A	Addgene	Codice 27268	conservato a -20 °C
Plasmide pEGFP-N3	Addgene	Codice 62043	conservato a -20 °C
Poly(I:C)	Calbiochem	528906	conservato a -20 °C
Plasmide pPGK-Cre			F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, Nuove varianti della Cre ricombinasi inducibile: un nuovo mutante della proteina di fusione Cre-PR mostra una maggiore sensibilità e una gamma ampliata di inducibilità. Acidi nucleici Res. 29, 47e (2001). conservato a -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)	Jena Biosience	NU-1139S	conservato a -20 °C
Separatore QuadroMACS	Miltenyi Biotec	Codice 130-090-976	memorizzato presso RT
Anticorpo CD11b anti-topo di ratto, coniugato con APC	BioLeggenda	101212	conservato a 4 °C
Anticorpo F4/80 ratto-anti-topo, coniugato PE	eBioscience	12-4801-82	conservato a 4 °C
M-CSF ricombinante	Peprotech	315-02	conservato a -20 °C
Kit di purificazione dell'RNA: Kit di pulizia della trascrizione MEGAclear	ThermoFisher Scientifico	AM1908	conservato a 4 °C
Tensioattivo che degrada l'RNAsi: RnaseZAP	Sigma-Aldrich	Anno 2020	memorizzato presso RT
LPS ultrapuro da E.coli O111:B4	Invivogen		conservato a -20 °C
Plasmide IKKβ wild type	Addgene	Codice: 11103	conservato a -20 °C
Plasmide NEMO wild type	Addgene	Codice 27268	conservato a -20 °C