NOTA: Il seguente protocollo descrive i passaggi necessari per eliminare cellule specifiche utilizzando la fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT). Controlli e altri dettagli su NIR-PIT e vitalità cellulare possono essere trovati altrove.
1. Coniugazione di Infrared 700 (IR700) ad Anticorpi Monoclonali (mAb)
- Preparare l'anticorpo monoclonale di interesse a 2-5 mg/ml in una soluzione di idrogeno fosfato disodico 0,1 M (Na2HPO4) (pH 8,6).
- Miscelare 6,8 nmol di mAb con 30,8 nmol di 10 mM IR700 in una soluzione 0,1 M Na2HPO4 (pH 8,6) in una provetta da microcentrifuga e incubare a RT per 1 ora, coperto con un foglio di alluminio.
- Lavare due volte la colonna PD-10 (vedi Tabella dei materiali/attrezzature) con 15 ml di PBS. Caricare l'esempio dal passaggio 1.2.
- Purificare la miscela tramite la colonna PD-10 mediante eluizione PBS secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Qui, l'eluizione era lungo il colore della banda di IR700. Per un campione da 300 μl, la frazione di eluizione PBS è tipicamente compresa tra 2,5 ml e 4,4 ml.
- Determinare la concentrazione proteica con la colorazione Coomassie misurando l'assorbimento a 595 nm con uno spettrofotometro. Determinare la concentrazione di IR700 con assorbimento a 689 nm per confermare il numero di molecole di fluoroforo coniugate a ciascuna molecola di mAb.
NOTA: È importante determinare un numero ottimale di coniugazione di molecole IR700 in 1 mAb con uno spettrofotometro. Generalmente, circa 3 molecole IR700 in 1 molecola di mAb sono ottimali sia per il lavoro in vitro che in vivo. Per confermare se l'mAb e l'IR700 sono legati o meno, è possibile utilizzare i metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e di elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE).
- Conservare a 4 °C dopo aver determinato la concentrazione proteica.
2. Preparazione di colture cellulari 3D miste (sferoidi misti)
- Applicare acqua sterile (circa 1 ml) nella sezione del serbatoio della piastra delle piastre a goccia sospese.
- Preparare vari rapporti dei tipi di cellule di interesse - cellule A431-luciferasi-proteina fluorescente verde (A431-luc-GFP) e cellule 3T3-proteina fluorescente rossa (3T3-RFP) - con ogni campione contenente 5.000 cellule in totale, sospeso in 50 μl di terreno di coltura.
NOTA: Preparare i rapporti 1:100, 10:100, 25:100, 50:100, ecc. dei tipi di cellule di interesse nei terreni di coltura a seconda del tipo di cellula.
- Incubare la miscela per 5-7 giorni nella piastra a goccia sospesa a 96 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di anidride carbonica. Cambiare i supporti di coltura ogni 2 giorni. NOTA: Per realizzare con precisione lo sferoide 3D, maneggiare delicatamente la piastra, poiché le gocce contenenti cellule cadono facilmente prima di formare forme 3D.
- Osserva la morfologia e le dimensioni degli sferoidi utilizzando un microscopio a campo chiaro invertito con ingrandimento 10X - 40X. NOTA: Sebbene dipenda dal tipo di cellula e dalle dimensioni della goccia sospesa, assicurarsi che il diametro dello sferoide sia di circa 400-600 μm dopo 7 giorni di incubazione nella piastra a goccia a 96 pozzetti.
3. NIR-PIT in vitro per colture cellulari 3D miste
- Sostituire il terreno delle piastre a goccia sospese in un terreno contenente 10 μg/ml di coniugato anticorpo-fotoassorbitore (APC) e incubare per 6 ore in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di anidride carbonica.
- Dopo 6 ore di incubazione, lavare due volte lo sferoide con terreno di coltura fresco (privo di rosso fenolo). Trasferire delicatamente lo sferoide in una piastra da 50 mm con fondo di vetro con 100 μl di terreno di coltura fresco privo di rosso fenolo utilizzando un puntale per pipetta sterile da 200 μl con il puntale tagliato. Metti uno sferoide in ogni piatto.
- Osserva lo sferoide con un microscopio a campo chiaro invertito per rilevare il cambiamento della morfologia. Per osservare i reporter ottici (ad esempio, GFP e RFP) utilizzare un microscopio a fluorescenza con le seguenti impostazioni del filtro: GFP — filtro di eccitazione da 469 nm e filtro di emissione da 525 nm; RFP — Filtro di eccitazione da 559 nm e filtro di emissione da 630 nm.
- Posizionare il diodo a emissione di luce (LED) sopra il piatto con fondo di vetro per l'irradiazione.
NOTA: Gli sferoidi possono essere esposti alla luce NIR sia al microscopio che nella cappa laminare.
- Misurare la densità di potenza della luce NIR con un misuratore di potenza ottica. In base a questa misurazione, irradiare la luce NIR tramite diodi emettitori di luce (LED) che emettono luce a lunghezze d'onda comprese tra 670 e 710 nm a 2 J/cm2,
NOTA: La luce LED può penetrare a una profondità massima di circa 5 pollici. Gli effetti citotossici del NIR-PIT dipendono solo da una data energia, indipendentemente dalla densità di potenza e dalla durata dell'esposizione.
- Dopo l'irradiazione, trasferire lo sferoide in una nuova piastra a goccia sospesa con 50 μl di terreno di coltura fresco e incubare per 1 giorno in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di anidride carbonica.
- Trasferire delicatamente lo sferoide in un piatto con fondo di vetro con 100 μl di terreno di coltura fresco (privo di rosso fenolo) utilizzando un puntale per pipetta sterile da 200 μl con il puntale tagliato. Osservare lo sferoide con un microscopio a fluorescenza 1 giorno dopo il NIR-PIT utilizzando le impostazioni del filtro descritte al punto 3.3.
- Rilevare le cellule morte aggiungendo ioduro di propidio al terreno a una concentrazione finale di 2 μg/ml o mediante perdita di fluorescenza GFP citoplasmatica utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 1B).
- Ripetere i passaggi 3.1-3.6 se le cellule bersaglio non sono state completamente eliminate.
