Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto. Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Generazione dei SUOI topi
- Allevamento di topi BALB/c -Rag2null, Il2RγCnull, SirpαNOD (BRGS), topi
nota: Questo ceppo è estremamente immunodeficiente, senza cellule T, B o natural killer (NK). Pertanto, è necessario utilizzare misure rigorose per prevenire le infezioni opportunistiche. Mantenere la colonia con una dieta contenente trimetoprim e sulfadiazina alternando un programma di 2 settimane con una dieta normale. Mantenere al massimo livello di precauzione possibile un locale abitativo (ad esempio, una struttura con docce a barriera con accesso limitato).
- Mantenere colonie di topi omozigoti BALB/c -Rag2null, Il2RγCnull, SirpαNOD (BRGS) e BALB/c Rag2null, Il2RγCnull, SirpaBalb/c (BRG) omozigoti come riproduttori.
- Allevare BRGSN/N×BRGB/B per generare cuccioli BRGSB/N, da utilizzare come riceventi di cellule staminali umane. In questa colonia, i BRGSB/N sono più sani dei BRGSN/N e si attecchiscono a livelli equivalenti (più dei BRG).
- Isolamento di cellule staminali umane CD34+ dal sangue del cordone ombelicale (CB)
nota: Per questa procedura non vengono utilizzati antibiotici. Pertanto, una buona tecnica sterile è imperativa.
- Posizionare un rack per provette coniche da 50 mL e 3 provette coniche da 15 mL e ~10x 50 mL in una cabina di biosicurezza (BSC) sterilizzata. Spruzzare una sacca per la raccolta del sangue con etanolo al 70% e lasciarla asciugare nel BSC.
- Calcolare il numero di provette coniche da 50 mL necessarie per l'isolamento del gradiente di densità CB = volume CB/15, arrotondato per eccesso e a un numero pari di provette. Calcolare il volume di sangue per provetta = volume CB/numero di provette. Versare accuratamente il sangue dalla sacca CB in ciascun tubo conico; si tratta di un massimo di 15 ml per provetta. Utilizzare un pipettatore automatico e una pipetta sierologica da 25 ml per miscelare il sangue 1:1 con PBS sterile mediante pipettaggio su e giù.
- Utilizzare un pipettatore automatico a bassa velocità e una pipetta sierologica da 10 mL per stendere lentamente il sangue con una soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente (RT) 1,077 g/mL (vedere la Tabella dei materiali) senza disturbare l'interfaccia. Evitare che la punta della pipetta tocchi il fondo della provetta. Ripetere per tutte le provette. Quindi centrifugare per 30 minuti a 850 x g, senza frenare, a RT per garantire il mantenimento del gradiente di densità.
- Visualizzate il buffy coat cellulare sopra il gradiente di densità di 1,077 g/mL come uno strato bianco torbido. Rimuovere ed eliminare lo strato di plasma fino a circa 10 mL sopra il buffy coat utilizzando una pipetta sierologica da 25 mL e un pipettatore automatico.
- Raccogliere il buffy coat con una pipetta sterile per trasferimento o sierologica. Utilizzare la pipetta come una spatola per raschiare le cellule dal lato del tubo conico mentre si rilascia il bulbo (o si pipetta lentamente) per aspirare le cellule. Combina i buffy coat di due provette coniche da 50 mL in una nuova provetta conica da 50 mL.
- Lavare le cellule versando 45 ml di soluzione salina bilanciata sterile di Hanks (HBSS) contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) in ciascun tubo conico. Centrifugare per 11 min a 360 x g a RT.
- Aspirare il mezzo di lavaggio fino al pellet in tutti i tubi. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 mL e un pipettatore automatico per risospendere il primo pellet in 10 mL di HBSS contenente il 2% di FBS. Risospendere ogni pellet negli stessi 10 mL di HBSS e sciacquare ogni provetta con altri 10 mL di HBSS per raccogliere tutte le cellule in un'unica provetta.
- Versare 45 mL di HBSS sterile contenente il 2% di FBS nella provetta conica. Centrifugare per 10 min a 360 x g, a 4 °C.
- Aspirare il tampone di lavaggio fino al pellet della cella e risospendere il pellet in 20 mL di tampone separatore magnetico delle celle (vedere la Tabella dei materiali). Rimuovere una piccola aliquota per contare le cellule con un ematocitometro a una diluizione di 1:20 in blu di metilene. Aggiungi il numero di celle blu e bianche. Centrifugare a 360 x g, per 10 min a 4 °C.
nota: Questo protocollo utilizza la tecnologia delle microsfere magnetiche (vedi Tabella dei materiali). Il protocollo può essere modificato per l'uso con qualsiasi tecnologia di separazione cellulare, con sufficiente purezza e resa delle cellule staminali CD34+.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule CD34+ isolato dal sangue del cordone ombelicale in 300 μL di tampone separatore cellulare magnetico per 1 x 108 cellule. Aggiungere prima 100 μl di reagente bloccante il recettore Fc (FcR) e poi 100 μl di biglie magnetiche CD34+ per 1 x 108 cellule. Incubare a 4 °C per 30 minuti (senza ghiaccio).
- Aggiungere 5 mL di tampone separatore di celle magnetiche per 1 x 108 celle e centrifugare a 360 x g per 10 minuti a 4 °C. Ripetere la fase di lavaggio e risospendere il pellet in 500 μL di tampone separatore di celle magnetiche per 1 x 108 celle in una provetta conica da 15 mL etichettata come "non frazionata".
- Etichettare altre due provette coniche da 15 mL "CD34-" e "CD34+". Posizionare le tre provette coniche da 15 mL (non frazionate, CD34- e CD34+) rispettivamente nelle fessure A1, B1 e C1 su una griglia di raffreddamento (vedere la Tabella dei materiali). Separare le celle utilizzando il programma di selezione positiva a due colonne su un separatore magnetico automatico di celle (vedi Tabella dei materiali) in un BSC, secondo le istruzioni dello strumento del produttore.
- Espansione e congelamento di cellule staminali umane CD34+
- Aliquotare 10 μL della sospensione cellulare CD34+ recuperata (2 mL) su un vetrino dell'emocitometro e contare le cellule con un ingrandimento di 10x. Calcola il numero totale di cellule CD34+ moltiplicando la conta cellulare per 2 x 104. Dividi il numero totale di cellule CD34+ per 250.000 per calcolare il numero di fiale da congelare (50.000 cellule per cucciolo di topo prima dell'espansione in vitro).
- Preparare il siero fetale di vitello (FCS) al 10% di CB medium Iscove (più 1 mL extra per la perdita di filtraggio), integrato con 40 ng/mL di fattore di cellule staminali, 20 ng/mL di ligando tirosin-chinasi 3 simile a FMS (Flt3L) e 10 ng/mL di interleuchina-6 (IL-6) e passare attraverso un filtro da 0,22 μm. Risospendere le cellule CD34+ a 100.000 per mL di terreno CB e incubare a 37 °C. Il giorno 3, aggiungere un volume equivalente di terreno CB senza citochine al pallone contenente le cellule e al terreno CB con citochine.
nota: L'aggiunta di queste citochine al terreno CB promuove la sopravvivenza e l'espansione delle cellule CD34+, prevenendo la differenziazione.
- Raccogli le cellule CD34+ espanse il giorno 5. Pipettare la sospensione cellulare su e giù e raccoglierla in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere una quantità di CB sufficiente a coprire il fondo del pallone. Usando un raschietto per cellule, raschiare l'intero fondo del pallone. Raccogliere tutti i terreni nella stessa provetta da 50 ml e centrifugare a 360 x g per 11 minuti.
- Risospendere le cellule in 2 mL di terreno CB. Conservare l'ultima goccia della pipetta in una piastra a 96 pozzetti per il conteggio. Diluire le cellule 1:1 in blu di tripano e aggiungere 10 μl all'ematocitometro, quindi contare e calcolare la media delle cellule da quattro quadranti. Calcola il numero totale di cellule CD34+ moltiplicando la conta cellulare per 4 x 104 e registra la vitalità.
- Produrre n+1 mL di terreno di congelamento, dove n è il numero di flaconcini di congelamento calcolato al punto 1.3.1. Preparare il terreno di congelamento aggiungendo il 10% (v/v) di dimetilsolfossido (DMSO) all'FBS e conservare in ghiaccio. Etichettare i crioviali con CB#, CD34+ d5 e data.
- Centrifugare le cellule CD34+ a 360 x g per 10 minuti a 4 °C. Aspirare il terreno fino al pellet e risospendere il pellet di cella nel mezzo di congelamento. Aliquotare 1 mL di sospensione cellulare in ciascun flaconcino e dividere uniformemente il resto tra i flaconcini. Aggiungere i flaconcini in un congelatore a cellule di isopropanolo raffreddato a 4 °C, porre a -80 °C e trasferire in azoto liquido per conservare per >90 giorni.
- Irradiazione di cuccioli di topo
- Raccogli i cuccioli BRGSB/N, 1-3 giorni dopo la nascita, in una scatola di plastica autoclavata con imbottitura. Aggiungi una piccola quantità di lettiera con i cuccioli. Etichetta la scatola con il numero della gabbia e il numero di cuccioli.
- Impostare l'irradiatore (vedi Tabella dei materiali) per una dose di 300 rad. Posizionare la scatola di cuccioli nell'irradiatore ed esporli a 300 rad. Rimetti i cuccioli nella loro gabbia, mettili in una pila e coprili con la lettiera.
- Iniezioni di cuccioli e preparazione delle cellule CD34+
- Iniziare la preparazione delle cellule CD34+ ~3 ore dopo l'irradiazione. Scaldare 10 mL di terreno CB in una provetta conica da 50 mL. Eseguire tutti i passaggi in un BSC sterile.
- Recuperare una fiala di cellule CD34+ espanse e congelate in vitro per ogni quattro o sei cuccioli da iniettare. Scongelare rapidamente a 55 °C, fino a quando non è visibile solo una piccola quantità di ghiaccio, e aggiungere le cellule al mezzo CB riscaldato (la fiala deve essere ancora fredda al tatto). Utilizzare 1 mL di terreno per sciacquare ogni fiala e centrifugare le cellule a 360 x g per 12 minuti a 4 °C.
NOTA: È stato riscontrato che lo scongelamento rapido a 55 °C produce una migliore vitalità cellulare (90%-95%) rispetto allo scongelamento a 37 °C.
- Aspirare il terreno con cura. Risospendere il pellet (piccolo) in 2 mL di terreno CB, mescolare delicatamente e aggiungere ~30 μL della sospensione cellulare in un singolo pozzetto in una piastra di conteggio. Diluire 1:1 in blu di tripano, quindi aggiungere 10 μl a un emocitometro e contare e fare la media delle cellule da quattro quadranti.
- Calcola il numero totale di cellule CD34+ moltiplicando la conta cellulare per 4 x 104 e quindi registra la vitalità. Centrifugare a 360 x g per 12 min a 4 °C.
- Aspirare con cura il terreno e risospendere il pellet cellulare in 100 μL di PBS sterile per n+1 cuccioli da iniettare, ottenendo 250.000-450.000 cellule CD34+ per topo. Posizionare il tubo conico sul ghiaccio in un contenitore per il trasporto e recarsi al vivaio per l'iniezione del cucciolo.
- Porta una lampada termica, pannolini, siringa da 1 ml, ago da 18 G, ago da 30 G e il preparato cellulare CD34+ in contenitori sterili al vivarium BSC. Metti un pannolino sterile ~2 piedi sotto il calore lamp. Recuperare la gabbia con la lettiera da iniettare e posizionarla nel BSC.
- Assemblare la siringa con un ago smussato da 18 G. Facendo corrispondere l'angolo del tubo conico con lo smusso dell'ago, mescolare delicatamente e aspirare la sospensione cellulare. Metti i cuccioli sul pannolino per scaldarli (fai attenzione al surriscaldamento). Rimuovere l'aria dalla siringa e sostituire l'ago da 18 G con l'ago da 30 G, quindi spingere con cautela la siringa fino a quando la sospensione cellulare non si trova proprio sulla punta dell'ago.
nota: In alternativa, è possibile utilizzare una siringa da insulina.
- Porta un cucciolo alla volta sul bordo del pannolino, lontano dalla lampada termica. Immobilizza il cucciolo su un fianco sotto il pollice e l'indice, consentendo una visione chiara del viso. Nota la vena sulla guancia sotto il punto in cui si troverà l'orecchio. Inserire l'ago in modo superficiale nella vena (IV) più vicina all'occhio e iniettare lentamente 50 μL di cellule.
- Controllare se si sta formando una bolla da un'iniezione sottocutanea. In tal caso, inserire l'ago più in profondità e procedere all'iniezione delle cellule. Una piccola goccia di sangue/ematoma sarà visibile in caso di successo.
- Con il cucciolo ancora immobilizzato, eseguire un'iniezione intraepatica (IH) con altri 50 μL di cellule (100 μL totali per cucciolo di IV+IH). Il fegato può essere visualizzato come una macchia scura tra la fascia bianca del latte e la gabbia toracica. Metti il cucciolo iniettato su un pannolino più lontano dai cuccioli non iniettati e riscaldalo.
nota: L'iniezione endovenosa provoca un migliore chimerismo a lungo termine rispetto alla sola iniezione di IH, ma le iniezioni endovenose non sempre hanno successo. Pertanto, la suddivisione dell'iniezione tra IV e IH garantisce l'attecchimento in una percentuale maggiore di topi.
- Ripetere sia le iniezioni della vena facciale che quelle di IH per tutti i cuccioli. Pulisci il sangue, riporta i cuccioli al nido nella loro gabbia e coprili con la lettiera.
