Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Inoculazione delle cellule
- Preparazione di cellule e animali
- Assicurarsi che la linea cellulare sia mantenuta nei terreni consigliati. Ad esempio, mantenere la linea cellulare WEHI 164 nel terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con 2 mM di L-glutammina, 10% di siero fetale bovino, 20 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanasolfonico (HEPES), 0,05 mM di 2-mercaptoetanolo, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
nota: Far passare le celle almeno 3 e fino a 5 volte dopo essere state rimosse dalla conservazione criogenica. Per garantire una vitalità cellulare ottimale, le cellule devono essere divise quando sono confluenti tra il 70 e l'80%. Le linee cellulari tumorali devono essere testate per il micoplasma, poiché l'infezione può alterare la crescita cellulare e influenzare la risposta immunitaria in vivo.
- Un giorno prima dell'inoculazione, radere i topi sul fianco inferiore destro usando le tosatrici.
nota: In questo esperimento sono stati utilizzati topi femmina BALB/c, di età compresa tra 8 e 12 settimane, di peso normale (16-22 grammi).
- Il giorno dell'inoculazione, raccogliere le cellule WEHI 164 quando sono confluenti al 70-80% per tripsinizzazione.
- Aspirare il terreno di coltura dai palloni di coltura tissutale e quindi aggiungere una soluzione tamponata con fosfato sterile (1x PBS), per rimuovere le tracce rimanenti di siero fetale bovino (FBS).
- Aspirare il PBS dai palloni di coltura tissutale. Aggiungere 3 mL di tripsina allo 0,05% (per un matraccio T75) e quindi agitare il pallone in modo che l'intera superficie del pallone con le cellule sia coperta da tripsina.
- Incubare il matraccio a 37 °C, incubatore al 5% di CO2 per 3 minuti. Controllare periodicamente le cellule, picchiettando sui lati del pallone per vedere se le cellule si sono staccate.
- Rimuovere le fiasche dall'incubatore per colture cellulari e aggiungere 5 mL di terreno integrato con FBS per neutralizzare la tripsina.
nota: Non lasciare le cellule nella tripsina più a lungo del necessario, poiché ciò può danneggiare le cellule e portare a una bassa vitalità cellulare.
- Sospensione a pipetta più volte per ottenere una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione della cella in una provetta da centrifuga conica.
- Pellet di celle centrifugando a 350 x g per 3 min.
- Lavare le celle tre volte in 1x PBS.
- Risospendere le cellule in 50 mL di PBS sterile 1x e lavare le cellule pipettando la sospensione cellulare su e giù. Pellet di celle centrifugando a 350 x g per 3 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 15 mL di PBS sterile. Lavare le cellule pipettando la sospensione cellulare su e giù. Pellet di celle centrifugando a 350 x g per 3 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in esattamente 10 mL di PBS sterile. Lavare le celle come al punto 1.1.4.2 e trasferire una piccola quantità (circa 100 μl) di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga per il conteggio. Pellet di celle centrifugando a 350 x g per 3 min.
- Determinare il numero di cellule utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Risospendere le cellule in 1x PBS sterile a una concentrazione di 5 x 106 cellule/mL. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
nota: La vitalità delle cellule tumorali deve essere uguale o superiore all'80 % per garantire una crescita tumorale riproducibile.
- Inoculazione sottocutanea
- Miscelare accuratamente la sospensione cellulare e riempire una siringa con un ago da 26 G con 100 μL di sospensione cellulare (5 x 105 cellule) in 1x PBS sterile. Ripetere la miscelazione delle cellule prima di caricare la siringa successiva.
nota: Mantenere le cellule in ghiaccio durante la procedura per mantenere la vitalità.
- Trattieni il mouse in modo appropriato, assicurandoti l'accesso al fianco inferiore destro. Inoculare il topo per via sottocutanea sul fianco inferiore destro rasato.
nota: Assicurarsi che l'inoculazione non sia nel peritoneo sollevando leggermente l'ago, che dovrebbe essere visibile sotto la pelle. Dopo l'inoculazione dovrebbe formarsi un nodulo simile a una bolla sotto la pelle.
- Monitorare i topi come richiesto dall'approvazione etica applicabile ed eseguire la resezione chirurgica quando i tumori hanno raggiunto una dimensione di circa 50 mm2.
2. Resezione chirurgica parziale del tumore
NOTA: Questo protocollo richiede DUE ricercatori; uno per le procedure chirurgiche (SURGEON) e un altro per il monitoraggio del topo (ASSISTANT).
- Configurazione chirurgica
- Il giorno 12 dopo l'inoculazione, quando i tumori hanno raggiunto una dimensione di circa 50 mm2, somministrare ai topi 100 μL (0,1 mg/kg) di buprenorfina s.c. nella collottola, 30 minuti prima dell'intervento chirurgico.
- Allestire l'area chirurgica con un termoforo coperto da un banco e allestire un cono nasale per l'anestesia. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima dell'uso e tra un animale e l'altro utilizzando uno sterilizzatore a microsfere termiche, lasciando raffreddare gli strumenti prima dell'uso. Tenere pulite e a portata di mano le seguenti attrezzature chirurgiche: clorexidina, tampone, garza, gel oculare, due pinze curve, forbici, applicatore di clip, dispositivo di rimozione delle clip e ricariche di clip (Figura 1A, 1B).
- Riscaldare la camera di riscaldamento a 37 °C e predisporre un altro termoforo per il recupero (Figura 1C). Posizionare gli strumenti sterilizzati su una superficie sterile come i tamponi autoclavati.
- anestesia
- Posizionare il topo nella camera di induzione e anestetizzarlo con isoflurano al 4% (4% in ossigeno al 100% a una velocità di flusso di 1 L/min) fino a quando la frequenza respiratoria rallenta a circa 60 respiri al minuto (1 al secondo) (di solito ci vogliono <1 min).
nota: Non lasciare il topo nella camera troppo a lungo in quanto ciò potrebbe portare ad asfissia e morte. Avere solo un topo sotto anestesia alla volta.
- Trasferire il mouse sul cuscinetto termico sul tavolo operatorio, posizionare il mouse con il naso nel cono del naso e mantenere lo stato anestetico con isoflurano al 3-4% in ossigeno al 100% a una velocità di flusso di 0,5 L/min. Monitorare la frequenza respiratoria per assicurarsi che la profondità dell'anestesia sia mantenuta.
nota: L'ASSISTENTE deve monitorare la respirazione del topo durante l'intervento chirurgico per garantire il mantenimento del corretto livello di anestesia. Abbassare la concentrazione dell'anestetico se la respirazione diventa troppo lenta o aumentare la concentrazione se la profondità dell'anestesia è troppo bassa. Se il topo inizia ad ansimare, rimuovere il topo dal cono del naso, diminuire la concentrazione di anestetico e attendere che la respirazione si normalizzi prima di posizionarlo nuovamente sul cono del naso.
- Eseguire un "test di pizzicamento" e un "test del riflesso corneale" per assicurarsi che il topo sia completamente anestetizzato prima di iniziare l'intervento chirurgico.
nota: Il movimento di qualsiasi parte del mouse è un'indicazione che il mouse non è completamente anestetizzato. All'animale deve essere immediatamente somministrato ulteriore anestetico aumentando la concentrazione di anestetico.
- Copri gli occhi del topo con una piccola quantità di gel oftalmico per evitare la secchezza oculare.
- Procedura chirurgica
- Tamponare l'area chirurgica 3 volte con clorexidina alcolica. Usando una pinza e un paio di forbici, praticare un'incisione diritta di 1 cm lungo il lato dorsale, a 3 mm di distanza dal tumore (Figura 2A, 2B).
nota: La standardizzazione dell'incisione a 1 cm in ogni topo (utilizzando un righello) consente una valutazione uniforme della guarigione delle ferite tra i topi. Localizzare l'incisione a 3 mm di distanza dal tumore consente la successiva terapia adiuvante intratumorale senza perdite dalla ferita.
- Usando una pinzetta, estrarre la faccia e il tessuto adiposo sottocutaneo tra il tumore e il peritoneo. Il tumore sottocutaneo è normalmente attaccato al lato della pelle.
- Aprire la ferita tenendo delicatamente la pelle sul lato portatore del tumore usando una pinzetta e "capovolgere" il tumore in modo che sia visibile all'esterno (Figura 2C, 2D).
nota: La sezione del tumore da debulking deve essere più vicina all'apertura per avere abbastanza pelle per chiudere la ferita. Fare attenzione a non tagliare la pelle durante la rimozione del tumore.
- Con l'aiuto di un paio di forbici, tagliare a metà la capsula tumorale per rimuoverla, partendo dalla base del tumore più vicina all'apertura.
- Per un intervento chirurgico di debulk al 50%, tagliare al centro del tumore. Utilizzando una pinza curva, prelevare la sezione del tumore da rimuovere (50%); Raccogli tutti i resti dall'area debulked.
- Per un debulk del 75%, eseguire un debulk del tumore al 50% come nella parte 2.3.5 sopra. Quindi tagliare a metà il restante 50% del tumore e raccogliere il 25% del tumore usando una pinza curva come descritto sopra.
- Chiusura del sito chirurgico
- Riposizionare il tumore rimanente sotto la pelle e, usando una pinza, unire i lembi di pelle e allineare la pelle lungo la ferita.
- Tenere insieme la pelle a 5 mm dal bordo della ferita e utilizzare clip chirurgiche per chiudere la ferita, iniziando dal lato più vicino alla pinza. Applicare tutte le clip necessarie per assicurarsi che nessun tessuto sottostante sia esposto. Generalmente, vengono applicate da tre a quattro clip con spazi di 2 mm tra le clip.
nota: Se alcune clip non sono applicate correttamente, rimuoverle utilizzando un dispositivo di rimozione delle clip e sostituirle con nuove clip.
- Recupero dei topi
- Lasciare che i topi si riprendano mettendoli nella camera di riscaldamento calda (37 °C).
- Posiziona la gabbia del mouse sul pad termico. Monitorare i topi nella camera di riscaldamento fino a quando non si sono ripresi dall'anestetico (svegli e camminando) e poi rimettere i topi nella gabbia. Lasciare la gabbia sul termoforo per altri 10 minuti, fino a quando i topi non sono diventati più attivi.
- Dai ai topi cibo umido e morbido. Monitora i topi 1 ora dopo l'intervento chirurgico per il recupero e assicurati che le clip rimangano in posizione. Assicurati che la gabbia sia per metà sopra e per metà fuori dal termoforo per consentire agli animali di autoregolare la temperatura mentre sono incustoditi.
- Somministrare ai topi 0,1 mg/kg di buprenorfina (100 μL per via sottocutanea nella collottola) 6-8 ore dopo l'intervento chirurgico (alla fine della giornata). Monitorare i topi la mattina seguente presto e somministrare nuovamente ai topi 0,1 mg/kg di buprenorfina (100 μL per via sottocutanea nella collottola). Somministrare più cibo umido secondo necessità.
- Monitora i topi ogni giorno per i prossimi sette giorni. Le clip possono essere rimosse dopo sette giorni utilizzando il dispositivo di rimozione delle clip.
- Trattamento adiuvante o neoadiuvante
- Trattare i topi perioperatoriamente con terapia (neo)adiuvante in qualsiasi momento, a seconda del trattamento di interesse.
- Ad esempio, trattare i topi con una dose di 100 μg di anti-CTLA-4 per via intraperitoneale (i.p.) il giorno 15 dopo l'inoculazione o con tre dosi di 200 μg di anti-PD-1 i.p. il giorno 15, 17 e 19 dopo l'inoculazione.
