Una tecnica per l'innesto di pelle umana in un modello murino

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Elaborazione di un campione di pelle umana di donatore

NOTA: Il campione di pelle umana utilizzato in questo trapianto era un grande campione raccolto dall'addome di un paziente sano. Il campione deve essere di almeno 15 cm x 7,5 cm. Le limitazioni dimensionali possono influenzare il numero di topi per i quali è disponibile la pelle e la scelta della dimensione dell'innesto.

1. Mantenere il campione di pelle a basse temperature (su ghiaccio; 4°C) prima della preparazione e dell'innesto. Mantenere il campione umido in una tazza chiusa per la raccolta dei campioni con la garza imbevuta di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   NOTA: Si sconsiglia di conservare il campione di pelle a 4 °C per più di 2 giorni. Tuttavia, esistono rapporti in cui i campioni di pelle vengono conservati per un tempo più lungo.
   cautela: Trattare tutti i tessuti umani con le precauzioni standard per il rischio biologico.
2. Preparare il dermatomero del campione di pelle umana in una cappa di coltura tissutale sterilizzata a pressione negativa su una tavola di dissezione sterilizzata.
3. Posizionare il campione di pelle, con l'epidermide rivolta verso l'alto, sulla tavola di dissezione. Pulisci l'epidermide con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol e poi con PBS.
4. Fissare il bordo più vicino della pelle in posizione con un perno a T da 1,5 pollici (vedere la tabella dei materiali).
5. Dermatome il campione di pelle a uno spessore di 400 μm, applicando una pressione costante mentre si taglia in avanti con un angolo di 30°-45°. Seguire tutte le istruzioni specifiche dello strumento e le misure di sicurezza (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Per i dettagli sulla tecnica del dermatomo, consultare un rapporto precedentemente pubblicato.
6. Preparare una capsula di Petri di 100 mm x 20 mm posizionando sul fondo della piastra una garza sterile imbevuta di PBS sterile. Posizionare la pelle, con l'epidermide rivolta verso l'alto, sulla garza bagnata.
7. Sigillare e coprire i bordi della piastra con una pellicola sigillante semitrasparente (vedere la Tabella dei materiali) per garantire che il campione non sia contaminato. Conservare il campione a 4° C prima dell'innesto.

2. Condizionamento e preparazione pre-operatoria

1. Preparare gli strumenti sterili e una stazione chirurgica sterile per l'innesto. Utilizzare asciugamani di carta autoclavati come superfici sterili per il posizionamento di strumenti e mouse.
   NOTA: I topi possono essere innestati dopo lo svezzamento, ma sono preferibilmente innestati tra le 8-10 settimane di età. Topi di entrambi i sessi possono essere innestati.
2. Eseguire la preparazione chirurgica, come la depilazione, in un'area fisicamente separata dalla stazione chirurgica.
3. Preparare l'anti-GR1 (vedi Tabella dei materiali) diluendolo a 1 mg/mL in soluzione fisiologica sterile. Dosare ogni topo con 100 μg/100 μL della soluzione anti-GR1 per via intraperitoneale dopo l'induzione dell'anestesia.
4. Anestetizzare i topi, uno alla volta, con isoflurano o altri anestetici istituzionalmente approvati.
   NOTA: L'isoflurano deve essere somministrato a una concentrazione del 3%-5% durante l'induzione. Una volta che il topo è immobile, abbassare la concentrazione di isoflurano all'1%-3% per influenzare la durata dell'intervento chirurgico.
   1. Monitorare il mouse per l'adeguata profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria, l'assenza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e l'appropriata colorazione rosa delle orecchie e della bocca.
      cautela: Utilizzare macchinari anestetici e metodi di evacuazione appropriati ed evitare l'esposizione ai vapori di isoflurano.
5. Trasferire il mouse su un termoforo o un'altra fonte di calore (vedere la Tabella dei materiali).
6. Somministrare l'unguento oftalmico tamponando una piccola goccia di unguento sull'occhio con un dito guantato.
7. Somministrare analgesici Buprenorfina (0,08 mg/kg) e Carprofene (5 mg/kg) (vedi Tabella dei materiali) per via sottocutanea pizzicando la pelle e iniettando con un angolo parallelo al corpo.
   NOTA: Preparare l'analgesia pre-trattamento seguendo i protocolli istituzionali. Seguire le linee guida istituzionali per la selezione e la somministrazione degli analgesici. Il metodo di analgesia utilizzato in questo studio è descritto nel passaggio 2.7 e nella Figura 1.
8. Somministrare l'anti-GR1 (preparato al punto 2.4) per via intraperitoneale sollevando leggermente il topo per la coda, esponendo l'addome e iniettando con un angolo di 30° utilizzando una siringa da insulina da 1 ml (12,7 mm).
9. Utilizzare tosatrici elettriche sicure per gli animali (vedere la Tabella dei materiali) per radere la parte centrale e superiore del lato dorsale del mouse.
10. Elimina tutti i peli e applica una generosa quantità di unguento depilatorio sulla pelle rasata per 30 s a 1 minuto.
11. Pulisci completamente l'unguento depilatorio con un tovagliolo di carta e PBS.

3. Procedura di trapianto

1. Trasferire il mouse in una posizione chirurgica secondaria, lontano dalla stazione di depilazione.
2. Sterilizzare il sito chirurgico con il bastoncino di tampone di iodio con un movimento circolare, partendo dal centro e procedendo verso il bordo dell'area depilata.
3. Metti un pezzo di pellicola sterile sopra il topo e taglia una finestra nella plastica leggermente più grande delle dimensioni dell'area da innestare.
4. Tagliare una porzione di pelle del donatore di 10 mm x 10 mm a forma di rettangolo da innestare con un bisturi. Fallo tenendo saldamente in posizione la pelle del donatore con la parte posteriore della pinza e tagliando lungo la pinza con il bisturi.
5. Usando le forbici chirurgiche, taglia un'area rettangolare di pelle di topo che corrisponda alle dimensioni del pezzo di pelle del donatore, creando un letto di innesto. Usa una pinza per allontanare la pelle dal corpo e taglia la pelle con le forbici angolate lontano dal corpo per evitare di tagliare in profondità la facciata.
6. Posizionare il pezzo di pelle del donatore, con l'epidermide rivolta verso l'alto, sul letto di innesto preparato.
7. Usando la parte posteriore della pinza, manipolare la pelle, facendola scorrere avanti e indietro fino a quando la pelle del donatore non si trova completamente piatta contro il letto dell'innesto.
8. Aggiungere gocce di colla chirurgica per tessuti adesivi (vedere Tabella dei materiali) nel punto in cui la pelle del donatore incontra la pelle del topo e del topo e del donatore insieme con una pinza per 1-2 secondi in modo che la colla aderisca ai tessuti. Sigillare completamente il bordo dell'innesto e lasciare asciugare completamente la colla.
9. Bendare i topi (Figura 2) seguendo i passaggi seguenti.
   1. Tagliare un pezzo di garza di vaselina (vedi Tabella dei materiali) abbastanza grande da coprire completamente l'area dell'innesto.
   2. Coprire l'innesto con la garza di vaselina e premere leggermente la garza contro la pelle con una pinza.
   3. Tagliare una striscia di pellicola trasparente nel senso della lunghezza in modo che la larghezza sia abbastanza grande da coprire la ferita del topo.
   4. Premere con decisione la medicazione in pellicola trasparente, con l'adesivo rivolto verso il basso, sulla garza. Arrotola rapidamente il mouse per avvolgere completamente la medicazione attorno al busto, assicurandoti che aderisca perfettamente senza ostacolare la respirazione e che tutti gli arti siano liberi di muoversi.
   5. Metti il mouse in una gabbia di recupero e monitoralo finché non è vigile e si muove. Fornire una fonte di calore su una parte della gabbia per almeno 15 minuti dopo il recupero.
      NOTA: Gli animali dovrebbero riprendersi entro 1-5 minuti dopo essere stati messi nella gabbia di recupero.

Figura 1: Cronologia del protocollo adottato per lo studio sugli xenotrapianti.

Figura 2: Metodo per fasciare il topo dopo l'intervento chirurgico. Il topo è avvolto strettamente in una garza di vaselina e in una medicazione in pellicola trasparente mentre è sotto anestesia. (A) La garza di petrolato viene posizionata su un'area leggermente più grande della ferita chirurgica. (B) Viene preparata la medicazione con film trasparente: una lunga striscia viene tagliata leggermente più larga della garza di petrolato. Il supporto che copre il lato adesivo della medicazione in film trasparente viene parzialmente rimosso. (C) Il lato adesivo della pellicola è saldamente premuto contro la parte posteriore del mouse, lasciando un pollice di spazio sull'estremità anteriore della pellicola. (D) Il mouse è girato sul retro. La parte anteriore sporgente della pellicola viene premuta sul mouse e il supporto viene rimosso. (E) Il mouse è avvolto strettamente nella pellicola e il supporto rimanente viene rimosso mentre il mouse viene avvolto. (F) Il topo è avvolto con successo nella medicazione e le sue braccia e gambe non sono costrette.