Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto. Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Istituzione di un modello umano basato su PBMC
- Mieloablazione di topi NOD/SCID mediante ciclofosfamide: determinazione delle dosi ottimali
- Acquista topi femmina non obesi diabetici/immunodeficienza combinata grave (NOD/SCID) (6-8 settimane).
nota: Tutti i topi coinvolti in questo studio erano femmine.
- Preparare la ciclofosfamide (CP) a dosi diverse (50, 100 e 150 mg/kg) in soluzione fisiologica. Preparare il disulfiram (DS) in Tween-80 allo 0,8% in soluzione fisiologica a 125 mg/kg.
NOTA: Sono state preparate diverse concentrazioni di CP per consentire la somministrazione di volumi uguali di soluzione farmacologica a topi che ricevevano dosi diverse di CP.
- Trattare gli animali con CP (intraperitoneale, i.p.) e DS (perorale, p.o.) una volta al giorno per 2 giorni. Somministrare DS (p.o.) 2 ore dopo ogni dose di CP.
NOTA: La DS riduce l'urotossicità della CP nei topi ed è stato suggerito che la CP combinata con la DS abbia una neutropenia più duratura rispetto agli animali trattati con la sola CP. Il regime posologico di CP potrebbe dover essere predeterminato prima degli studi effettivi ed è stato riscontrato che varia leggermente tra i diversi ceppi di topo immunodeficienti.
- Raccogliere campioni di sangue dal seno venoso orbitale e trasferirli in provette rivestite di acido etilendiamminotetraacetico di potassio (EDTA-K) su ghiaccio il giorno 0 (1 ora prima della prima dose), il giorno 2 (24 ore dopo la seconda dose) e il giorno 4 (72 ore dopo la seconda dose).
- Esaminare l'effetto della mieloablazione dopo il trattamento con CP e DS mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Utilizzare il CD11b (M1/70) anti-topo di ratto, il Ly6C anti-topo di ratto (HK1.4) e il Ly6G anti-topo di ratto (1A8) per il gating CD11b+Ly6Calto come neutrofili, CD11b+Ly6Calto come monociti.
- Registra il peso corporeo e le condizioni di salute dei topi ogni giorno per una settimana. La dose ottimale di CP e DS è determinata come il regime che determina la massima deplezione di neutrofili e monociti senza causare grave tossicità ai topi.
- Trapianto di PBMC umano e attecchimento tumorale: set-up del modello
- Isolare le PBMC umane da donatori sani mediante centrifugazione in gradiente di densità secondo le istruzioni del produttore.
- Pretrattare i topi con CP e DS come indicato nei passaggi 1.1.2 e 1.1.3 per aumentare l'efficienza del trapianto.
- Da 20 a 24 ore dopo la seconda dose di CP e DS, iniettare una linea cellulare tumorale umana come cellule A431 (ATCC, 2,5 x 106) e 5 x 106 PBMC isolate (miscelate in un totale di 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente il 50% di Matrigel), o frammenti tumorali (3 x 3 x 3 mm3, in un volume totale di 200 μL di PBS contenente il 50% di Matrigel) e 200 μL di 5 x 106 PBMC (100 μL ciascuno sul lato sinistro e destro del frammento tumorale trapiantato) per via sottocutanea (s.c.) nel fianco destro degli animali.
- Misurare il volume del tumore primario e registrare due volte a settimana per 4-6 settimane.
nota: I topi saranno soppressi una volta che il loro peso corporeo perde oltre il 20% o il loro volume tumorale raggiunge i 2.000 mm3 o il tumore è ulcerato.
- Eutanasia dei topi nelle camere a gas con anidride carbonica. Raccogli l'intero tessuto tumorale nei topi sacrificati con le forbici oftalmiche ed elaborali per l'analisi istologica e immunoistochimica (IHC). Esaminare le espressioni umane di CD8, PD-1 e PD-L1 in questi tessuti.
