Inibizione dell'autofagia basata su siRNA in cellule dendritiche immature infettate da virus dell'herpes simplex

Abstract

Fonte: Düthorn, A., et al. Elettroporazione di siRNA per modulare l'autofagia nelle cellule dendritiche derivate da monociti infettate dal virus dell'herpes simplex di tipo 1. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra una tecnica basata su piccoli RNA interferenti (siRNA) per interferire con il flusso autofagico. Un siRNA che ha come bersaglio l'mRNA di FIP200 viene introdotto in cellule dendritiche immature (iDC) derivate da monociti utilizzando l'elettroporazione, causando il knockdown dell'espressione di FIP200 e portando all'inibizione della distruzione della lamina nucleare attraverso l'autofagia. Dopo l'aggiunta del virus dell'herpes simplex (HSV), l'uscita nucleare della progenie virale viene inibita a causa dell'assenza di interruzione della lamina attraverso il flusso autofagico.

Protocollo

Le DC derivate da monociti sono state generate da prodotti di leucaferesi di donatori sani. A tal fine, è stato ottenuto un voto positivo dal comitato etico locale (numero di riferimento 4556). Gli esperimenti del presente studio sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni del comitato etico della "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (numero di riferimento 4556). Tutti i donatori hanno approvato un consenso informato scritto, compreso il rispetto della Dichiarazione di Helsinki.

1. Generazione e gestione di cellule dendritiche immature (iDC) e cellule dendritiche mature (mDC)

1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) dalle camere del sistema di leucoriduzione (LRSC) come descritto in precedenza. Evitare la crioconservazione delle PBMC e utilizzarle direttamente dopo l'isolamento per ottenere rese DC più elevate.
2. Generare DC umane da PBMC di diversi donatori sani in fiasche di coltura cellulare T175 come descritto in precedenza. In breve, utilizzare 350-400 milioni di PBMC in 30 mL di terreno DC (RPMI 1640 senza L-glutammina, 1% (v/v) di siero umano di tipo AB (siero AB), 100 U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 0,4 mM di L-glutammina, 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico (HEPES)) per fiaschetta di coltura cellulare per l'isolamento dei monociti mediante aderenza. Dopo 1 ora, lavare via la frazione non aderente utilizzando RPMI 1640. Aggiungere un terreno DC fresco integrato con 800 U/mL di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) e 250 U/mL di interleuchina-4 (IL-4) e incubare per 3 giorni.
   1. Il giorno 3 dopo l'aderenza, aggiungere 5 mL di terreno DC fresco contenente GM-CSF e IL-4 con una concentrazione finale di 400 U/mL e 250 U/mL per matraccio di coltura cellulare, rispettivamente, per la differenziazione DC.
   2. Per raccogliere le iDC, sciacquare delicatamente le iDC poco aderenti dal fondo del pallone di coltura cellulare, il giorno 4 dopo l'aderenza. Ripeti questo passaggio 2 volte. Per la generazione di mDC, aggiungere un cocktail di maturazione composto come segue: GM-CSF (concentrazione finale: 40 U/mL), IL-4 (concentrazione finale: 250 U/mL), interleuchina-6 (IL-6, concentrazione finale: 1000 U/mL), Interleuchina-1 beta (IL-1β, concentrazione finale: 200 U/mL), Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-α, concentrazione finale: 10 ng/mL), prostaglandina E2 (PGE2; concentrazione finale: 1 μg/mL).
   3. Sei giorni dopo l'aderenza (due giorni dopo l'induzione della maturazione utilizzando un cocktail di citochine), sciacquare le mDC dal fondo del pallone di coltura cellulare. Ripetere questo passaggio due volte.
      nota: Le DC immature e mature possono essere generate in sequenza da donatori identici in 1 matraccio di coltura cellulare. A tal fine, i) separare il numero appropriato di iDC e ii) indurre la maturazione delle cellule rimanenti nei flaconi utilizzando il cocktail di citochine elencato al punto 1.2.2.
3. Trasferire iDC o mDC nel rispettivo terreno di coltura cellulare in provette da 50 mL. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti.
   1. Risospendere delicatamente (= lavare) le DC in 5-10 mL di RPMI 1640 per matraccio di coltura cellulare. Combina le rispettive sospensioni CC in un unico tubo.
   2. Definisci il numero di celle utilizzando una camera di conteggio o un metodo alternativo. Evitare le alterazioni di temperatura durante la manipolazione delle iDC, per ridurre il rischio di cambiamenti fenotipici.

2. Analisi citofluorimetriche per monitorare lo stato di maturazione fenotipica

1. Trasferire iDC o mDC (0,5 x 10⁶) dal passaggio 1.3.1 in una provetta da 1,5 mL. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3390 x g per 1,5 min. Lavare le cellule una volta con tampone FACS (PBS integrato con siero fetale di vitello (FCS) al 2%).
2. Risospendere le cellule in 100 μL di soluzione di colorazione degli anticorpi (tampone FACS) contenente anticorpi specifici marcati con fluorocromo contro molecole di superficie definite.
   1. Utilizzare i seguenti anticorpi per verificare la purezza (CD3- isotiocianato di fluoresceina [FITC], CD14-ficoeritrina [PE]) e lo stato di maturazione delle DC (CD80-PacBlue [Pacific Blue]/-PE-cianine5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. Preparare un campione non colorato in 100 μl di tampone FACS come controllo.
   3. Colorare le cellule sul ghiaccio al buio per 30 minuti.
3. Successivamente lavare le cellule due volte in 1 mL di tampone FACS e centrifugare a 3390 x g per 1,5 min.
4. Infine, risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS integrato con paraformaldeide (PFA) al 2% e analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Le celle fisse possono essere conservate a 4° C al buio fino a 2 giorni.

3. Interferenza del flusso autofagico indotto da HSV-1 tramite elettroporazione di iDC utilizzando FIP200-siRNA

NOTA: L'attuale protocollo per l'elettroporazione dei siRNA è stato modificato da Prechtel et al. (2007) e Gerer et al. (2017).

1. Trasferire le iDC (12 x 10⁶) al giorno 3,5 dopo l'aderenza in una provetta da 50 mL. Successivamente, centrifugare le celle a 300 x g per 5 min e scartare il surnatante. Parallelamente, eseguire l'analisi citofluorimetrica per monitorare lo stato di maturazione come descritto nella fase 2 (utilizzare Life/Dead violet invece di CD80-PacBlue).
2. Lavare delicatamente le iDC in 5 mL di OptiMEM senza rosso fenolo e centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere delicatamente le iDC in 200 μL di OptiMEM senza rosso fenolo, regolando una concentrazione cellulare di 6 x 10⁶/100 μL. Non posizionare le celle sul ghiaccio ed evitare alterazioni di temperatura. Procedi rapidamente ed evita lunghi periodi di incubazione di iDC in OptiMEM senza rosso fenolo.
3. Trasferire 75 pmol di siRNA specifico per FIP200 o 75 pmol di siRNA criptato, come controllo, in elettrocuvette da 4 mm e aggiungere 100 μl (6x10⁶ cellule) della sospensione cellulare. Pulsare direttamente gli iDC utilizzando l'apparecchio di elettroporazione I, applicando le seguenti impostazioni: 500 V per 1 ms.
   1. Prima della procedura sperimentale, preparare le sospensioni di siRNA secondo le istruzioni del produttore, aliquotarle e conservarle a -20 °C. Scongelarle e tenerle in ghiaccio quando si utilizzano questi siRNA per l'elettroporazione. Prima di elettroporare i campioni, eseguire un impulso di prova.
4. Dopo l'elettroporazione, trasferire direttamente l'iDC in piastre a 6 pozzetti con terreno DC fresco preriscaldato (integrato con 40 U/mL di GM-CSF e 250 U/mL di IL-4). Seminare le cellule a una concentrazione finale di 1 x 10⁶/mL e metterle in un incubatore. Non sciacquare le celle dall'elettrocuvetta.
5. Dopo 48 ore, esaminare prima la morfologia delle iDC elettroporate al microscopio. Quindi, raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare e trasferirle in provette da 15 mL. Sciacquare i pozzetti con 1 mL di PBS addizionato con acido etilendiamminotetraacetico allo 0,01% (EDTA) e trasferire la soluzione nelle rispettive provette.
6. Successivamente, dividere 6 x 10⁶ iDC per condizione di siRNA come descritto nei passaggi successivi.
   1. Utilizzare 0,5 x 10⁶ celle per valutare lo stato di maturazione e la vitalità cellulare come descritto nella fase 2. Utilizzare i seguenti anticorpi: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 e Life/Dead violet.
   2. Utilizzare 1 x 10⁶ celle per le analisi Western blot per verificare l'efficienza di knockdown specifica per FIP200. Trasferire e raccogliere le cellule in una provetta safelock da 1,5 mL mediante centrifugazione a 3390 x g per 1,5 min. Preparare lisati cellulari ed eseguire analisi Western blot.
   3. Utilizzare le celle rimanenti (4,5 x 10⁶) per gli esperimenti di infezione da HSV-1. Per ogni condizione sperimentale, trasferire 2,25 x 10⁶ iDC in provette da 2 mL e infettarle con HSV1 a una molteplicità di infezione (MOI) di 2 o aggiungere un tampone MNT come controllo simulato. Eseguire l'infezione come descritto.
   4. A 20 ore dall'infezione (hpi), raccogliere le cellule utilizzando un raschietto cellulare e preparare i lisati cellulari per le analisi Western blot.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Unità centrale 4D-Nucleofector (apparecchio di elettroporazione II)	Lonza (Basilea, Svizzera)	Codice AAF-1002B
AB-Siero	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germania)	H4522	Coltivazione di cellule dendritiche
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germania)	9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (kit di elettroporazione apparecchio II)	Lonza (Basilea, Svizzera)	V4XP-3024
Reagente per la rilevazione di Western blotting Amersham ECL Prime	GE Healthcare (Solingen, Germania)	RPN2232	Rilevamento Western Blot
Persolfato di ammonio (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germania)	Trasmissione A3678
anti-topo-IgG (topo, policlonale, HRP)	Segnalazione cellulare (Leida, Paesi Bassi)	7076	Rilevamento Western Blot
anti-coniglio-IgG (capra, policlonale, HRP)	Segnalazione cellulare (Leida, Paesi Bassi)	Codice: 7074	Rilevamento Western Blot
Citometro a flusso BD FACS Canto II	BD Biosciences (Heidelberg, Germania)	338962
camera di blotting Fastblot B44	Biometra (Göttingen, Germania)	846-015-100
CCR7 (mouse, Pe-Cy7)	BioLegend (Fell, Germania)	557648	Citometria a flusso Diluizione: 1:100 clone: G043H7
CD11c (topo, Pe-Cy5)	BD Biosciences (Heidelberg, Germania)	561692	Citometria a flusso Diluizione: 1:100 Clone: B-ly6
CD14 (topo, EP)	BD Biosciences (Heidelberg, Germania)	555398	Citometria a flusso Diluizione: 1:100 Clone: M5E2
CD3 (mouse, FITC)	BD Biosciences (Heidelberg, Germania)	555332	Citometria a flusso Diluizione: 1:100 Clone: UCHT1
CD80 (mouse, V450)	BD Biosciences (Heidelberg, Germania)	560442	Citometria a flusso Diluizione: 1:100 Clone: L307.4
CD83 (mouse, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germania)	Codice 17-0839-41	Citometria a flusso Diluizione: 1:200 Clone: HB15e
CD86 (mouse, PE)	BD Biosciences (Heidelberg, Germania)	553692	Citometria a flusso Diluizione: 1:100
Imaging cellulare EVOS FL	Sistema AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA)	AMF4300
FIP200 (coniglio)	Segnalazione cellulare (Leida, Paesi Bassi)	Codice: 12436	Rilevamento Western Blot Diluizione: 1:1000 Clone: D10D11
Apparato Gene Pulser II (apparato di elettroporazione I)	BioRad Laboratories GmbH (München, Germania)	Codice 165-2112
GM-CSF (4x104 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germania)	130-093-868
HLA-DR (mouse, APC-Cy7)	BioLegend (Fell, Germania)	307618	Citometria a flusso Diluizione: 1:200 Clone: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BioVex		Infezione da DC
IL-1β (0,1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Friburgo, Germania)	Codice 1411-050
IL-4 (1x106 U/mL)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germania)	Codice 130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH (Friburgo, Germania)	Codice 1404-050
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (Solingen, Germania)	28955810
L-glutammina	Lonza (Basilea, Svizzera)	17-605E
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte viola riparabile	Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)	L34964	Colorazione L/D nella citometria a flusso
Lymphoprep	Alere Technologies AS (Oslo, Norvegia)	04-03-9391/01
cloruro di magnesio	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germania)	Codice: A537.1
Megafuge 2.0 RS	Heraeus (Hanau, Germania)	75015505
Camera di conteggio Neubauer	Marchio (Wertheim, Germania)	717805
Nunc Fiasche per colture cellulari (175,0 cm2)	Thermo Scientific (Rockford, Stati Uniti)	Codice 159910
Paraformaldeide, 16 %	Alfa Aesar, Haverhill, Stati Uniti	43368.9M
PerfectSpin 24 Plus	Peqlab (Erlangen, Germania)	C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL)	Pfizer (Berlino, Germania)	BE130681
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Lonza (Basilea, Svizzera)	17-512F
RestoreTM Tampone di strippaggio Western Blot	Thermo Scientific, Rockford, Stati Uniti	Codice: 21059
Piattaforma a dondolo wt 15	Biometra (Göttingen, Germania)	Codice 042-590
RotiBlock	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germania)	A151.4
Carico rotativo 1 (4x)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germania)	K929.3
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germania)	3029.1
RPMI 1640	Lonza (Basilea, Svizzera)	12-167F
Sodio dodecil solfato (SDS)	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germania)	Codice 2326,2
Thermomixer comfort	Eppendorf (Amburgo, Germania)	5355 000.011
TNF-α (10 μg/mL)	Peprotech (Amburgo, Germania)	300-01A
Tris	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germania)	4855.3
Soluzione di blu di tripano (0,4 %)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germania)	T8154
Interpolazione 20	Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germania)	Codice 9127.1
Membrana in nitrocellulosa Whatman da 0,2 μm	GE Healthcare (Solingen, Germania)	10600001
Carta per cromatografia WhatmanTM 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germania)	3030917