Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparativi prima di iniziare l'intervento chirurgico
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (ad esempio, mediante autoclave).
- Diluire il virus alla concentrazione appropriata, che varierà a seconda della tossicità del virus specifico utilizzato e della suscettibilità del ceppo di ratto.
NOTA: Ad esempio, quando si utilizza il virus della stomatite vescicolare nei ratti Buffalo maschi, in genere iniettiamo 107 unità formanti placche (pfu) in un volume di 1 ml, che è la dose massima tollerata in quel modello.
- Preriempire il virus (utilizzando la tecnica asettica) in siringhe da 1 ml e inserire aghi da 30 G, avendo cura di eliminare l'aria dalla siringa e dall'ago.
- Preparare lo spazio chirurgico con tutti i materiali e le attrezzature necessarie e spruzzare l'area con etanolo per disinfettarla. Riempire un piccolo recipiente con soluzione salina sterile (cloruro di sodio allo 0,9%, NaCl) per inumidire i tamponi di garza e gli applicatori con punta di cotone.
2. Preparazione del Topo
- Somministrare un analgesico (come specificato dal comitato locale per la cura e l'uso degli animali), alla dose appropriata 30 minuti prima di iniziare la procedura chirurgica. Ad esempio, somministrare una dose elevata di metamizolo (100-200 mg/kg).
- Anestetizzare il ratto utilizzando l'anestesia per inalazione (isoflurano) o iniettabile (cioè una miscela di medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2 mg/kg) e fentanil (0,005 mg/kg), nota anche come MMF). Somministrare l'isolflurano attraverso un vaporizzatore all'1-3% e regolare se necessario per mantenere la normale respirazione e frequenza cardiaca.
- Prima di procedere, assicurarsi che il ratto sia completamente sedato e non sia in grado di provare dolore pizzicando il cuscinetto del piede e osservando una reazione.
- Applicare un unguento veterinario per gli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Radere la zona addominale dallo sterno fino a poco sopra i genitali usando un piccolo tagliacapelli veterinario. Fare attenzione a ottenere una rasatura profonda senza ferire la pelle.
- Fissare il ratto al letto chirurgico utilizzando del nastro adesivo sugli arti anteriori e posteriori e, se si utilizza l'anestesia per inalazione, posizionare il muso in un cono nasale di dimensioni adeguate. Posiziona un termoforo sotto il ratto per mantenere la temperatura corporea. Disinfettare la zona addominale utilizzando un disinfettante di grado chirurgico, seguito da un risciacquo con alcol e l'applicazione di una vernice antisettica.
3. Laparotomia
- Usando un piccolo bisturi curvo, come il #15, fai una piccola incisione verticale nello strato cutaneo direttamente lungo la linea mediana. Estendere l'incisione fino al processo xifoideo. Quindi, incidere lo strato muscolare sollevandolo delicatamente con un paio di pinze Adson per praticare un'incisione con il bisturi, quindi estendere l'incisione fino al processo xifoideo con le forbici chirurgiche. Fare attenzione a non perforare gli organi della cavità addominale o a danneggiare i piccoli vasi su entrambi i lati del processo xifoideo.
- Posiziona un divaricatore sull'addome per allargare il muscolo e la pelle ed esporre l'intera area addominale.
- Inumidire due tamponi di garzada 7,5 x 7,5 cm 2 con soluzione fisiologica sterile e distribuirne uno sulla parte superiore dell'apertura chirurgica e uno sul fondo, come mostrato nella Figura 1A.
4. Isolamento dell'arteria epatica
- Utilizzando due tamponi applicatori di cotone inumiditi con soluzione fisiologica sterile, sollevare delicatamente l'intestino e il cieco dalla cavità addominale e posizionarli sul tampone di garza inferiore. Piega la garza per mantenere gli organi umidi e per tenerli lontani.
- Utilizzando due tamponi applicatori di cotone inumidito, sollevare delicatamente il lobo epatico laterale sinistro, che sarà il lobo più predominante in vista in questa fase. Capovolgere il lobo verso l'alto e, usando un piccolo paio di forbici a molla, tagliare la membrana fibrosa sul lato inferiore del lobo, permettendo al lobo di essere completamente capovolto verso l'alto e di poggiare sopra il tampone di garza precedentemente posizionato. Piega il tampone di garza sul lobo per tenerlo in posizione.
- Continua con il lobo successivo (il caudato anteriore), che ora è il lobo più anteriore in vista. Con l'aiuto di un microscopio da dissezione e di una pinza fine, sezionare la sottile membrana che circonda il lobo per rilasciarla e consentirne il libero ribaltamento verso l'alto. Posizionare il lobo sotto il tampone di garza insieme al lobo laterale sinistro.
- Osservare il lobo caudato posteriore, che ora sarà visibile. Ripetere il passaggio 4.3 per sezionare completamente il lobo caudato posteriore e capovolgerlo verso l'alto e all'interno della garza insieme ai lobi epatici precedentemente posizionati.
- Appena sotto la posizione originale del lobo caudato, trova l'arteria epatica comune, che ora sarà visibile e facilmente riconoscibile per la sua forte pulsazione. Seguendo l'arteria verso l'anatomia destra, osservare lo spesso materiale membranoso che oscura alla vista le arterie gastroduodenali e le arterie epatiche corrette. Usando una pinza fine, solleva questo materiale e strappalo delicatamente, facendo attenzione a evitare piccoli vasi in quest'area. Utilizzare tamponi applicatori di cotone per fermare eventuali sanguinamenti che potrebbero verificarsi.
- Localizzare i rami arteriosi, che saranno chiaramente visibili con l'aiuto di un microscopio da dissezione quando le membrane sono state sezionate correttamente.
- Utilizzando due pinze sottili e atraumatiche, sezionare attentamente l'arteria epatica comune, l'arteria gastroduodenale e l'arteria epatica corretta in modo che vengano liberate dalle membrane circostanti (Figura 1B).
5. Preparazione dell'arteria per l'iniezione
- Passare una sutura di prolene 7-0 sotto l'arteria gastroduodenale e utilizzare un porta micro-ago per legare una legatura permanente all'estremità distale, appena sopra la biforcazione (vedere la Figura 2 per il corretto posizionamento). Lasciare che rimangano circa 2 pollici di materiale di sutura sulle estremità e bloccarle con un porta-aghi per tirare l'arteria appresa, come nella Figura 1C.
- Posizionare un piccolo morsetto sull'arteria epatica comune per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno (Figura 1C).
NOTA: Questo è importante per prevenire sanguinamenti massicci una volta rimosso l'ago dall'arteria. Inoltre, l'ostruzione del flusso sanguigno arterioso consentirà una somministrazione più lenta del virus e una migliore efficienza di trasduzione.
- Importante: Lavorare rapidamente per limitare la quantità di tempo in cui il flusso sanguigno viene interrotto - eseguire l'iniezione e la successiva legatura dell'arteria entro 5 minuti dal bloccaggio dell'arteria epatica comune.
- Se possibile, aumentare l'ingrandimento del microscopio da dissezione, in modo che l'arteria gastroduodenale sia a fuoco e appaia abbastanza grande da inserire con precisione l'ago da 30 G. Posizionare l'ago della siringa per iniezione nel lume dell'arteria gastroduodenale e spingere lentamente sullo stantuffo.
NOTA: Il corretto posizionamento dell'ago farà sì che la soluzione iniettata fluisca direttamente attraverso l'arteria epatica corretta e verso il fegato.
- Eseguire l'iniezione molto lentamente per massimizzare l'efficienza di trasduzione.
- Una volta somministrato l'intero volume di iniezione, ritrarre lentamente l'ago dall'arteria.
NOTA: Non ci dovrebbe essere sanguinamento dal sito di iniezione. Nel caso in cui si verifichi un sanguinamento, indica che il morsetto non è posizionato correttamente e deve essere regolato rapidamente.
6. Chiusura
- Passare una seconda sutura 7-0 Prolene sotto l'arteria gastroduodenale e legare una seconda legatura permanente sopra il sito di iniezione.
- Rimuovere il morsetto dall'arteria epatica comune. Verificare che il flusso sanguigno attraverso l'arteria epatica corretta verso il fegato sia stato ripristinato.
- Taglia le estremità libere delle legature.
- Verificare che non ci siano sanguinamenti prima di riportare l'intestino e il fegato nella cavità addominale. Fare attenzione che l'appendice venga restituita con l'orientamento originale.
- Sutura il muscolo e la pelle in strati separati utilizzando materiale di sutura vicryl 4-0 con un ago curvo. Posizionare le suture continue a circa 1 mm di distanza l'una dall'altra e tirare forte.
- Durante la fase di sutura, somministrare un analgesico come la buprenorfina (0,05 mg/kg).
- Rimuovere il ratto dall'anestesia. Se è stato usato isoflurano, il ratto dovrebbe riprendere conoscenza entro pochi minuti. Se l'MMF è stato utilizzato come anestesia iniettabile, inimicarlo con un'iniezione sottocutanea di atipamezolo (0,75 mg/kg), flumazenil (0,2 mg/kg) e naloxone (9,12 mg/kg), che invertirà gli effetti dell'anestesia e consentirà agli animali di riprendere conoscenza entro 20 minuti. Mantieni i ratti al caldo con una lampada riscaldante a infrarossi durante la fase iniziale di risveglio.
- Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
- Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
