Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Animali
- Coltiva topi femmina C57BL6/J fino a 8 settimane di età in gabbie ventilate individualmente con filtri di microisolamento.
NOTA: Le femmine sono preferite perché la conformazione anatomica del loro apparato urogenitale esterno rende il cateterismo più facile rispetto ai maschi.
2. Coltura cellulare
- Mantenere la linea cellulare di carcinoma uroteliale di topo MB49 in terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente e 50 μg/ml di gentamicina a 37 °C in anidride carbonica (CO2) umidificata al 5%.
- Coltiva le cellule MB49 in fiasche T-75 all'80% di confluenza. Tripsinizzare e risospendere a 0,5 × 10,5 - 0,5 × 10,6 cellule per 150 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima dell'impianto nei topi.
3. Impianto di tumore intravescicale
- Anestetizzare i topi utilizzando una miscela di anestetici zoletil e xilor (rispettivamente 33 mg/kg e 20 mg/kg), iniettati per via intraperitoneale.
- Metti gli animali in posizione supina e fissa le zampe posteriori al cuscinetto con dello scotch. Le zampe devono essere sufficientemente separate per rendere il meato uretrale ben visibile e facilmente accessibile per l'inserimento del catetere.
- NOTA: Per il cateterismo, un catetere venoso pediatrico da 24 G è adatto a topi di età compresa tra 8 e 10 settimane. La scelta del catetere è fondamentale per evitare perdite di liquido tra la parete uretrale e il catetere. I cateteri di diametro maggiore devono essere utilizzati per i topi più grandi o più vecchi.
- Usando una piccola tronchesina, pizzicare un bordo della parte esterna dell'uretra e ruotarlo molto delicatamente verso la "testa di testa" dei topi. Questa azione espone il meato uretrale.
- Rimuovere l'ago interno del catetere e inserire quest'ultimo nell'uretra con un angolo di 45°, leggermente orientato verso la "coda" dei topi. Non forzare l'ingresso del catetere; In caso di resistenza, basta ruotare il catetere molto delicatamente fino a farlo scivolare all'interno dell'uretra. Quando circa 0,5-0,8 cm del catetere si trovano nell'uretra, posizionare con cura il catetere parallelamente alla coda dei topi e inserirlo completamente.
- Utilizzando una siringa da 1 ml, il cui ago deve essere inserito nel catetere, lavare la vescica dall'urina residua iniettando 200-300 μl di PBS sterile e aspirare tutto il liquido dalla vescica.
- NOTA: Quando si inietta la PBS, la vescica si riempirà e il gonfiore sarà visibile tra le zampe posteriori dei topi; questo conferma che il cateterismo è corretto. La maggior parte dei cateteri ha un volume morto che deve essere considerato nel calcolo del volume di iniezione.
- Utilizzando una siringa sterile da 1 ml, iniettare 200 μl di acido cloridrico 0,1 N (HCl). Riempi la vescica per bruciare l'intera parete. Dopo 10 sec, rimuovere tutto l'acido e neutralizzare immediatamente iniettando 200 μl di idrossido di sodio 0,1 N (NaOH) con una siringa sterile. Nel caso di iniezione del maggior numero di cellule (0,5 × 106), la fase di acidificazione non è necessaria.
- Aspirare tutto il liquido residuo e lavare immediatamente la cavità con 300 μl di PBS sterile.
- Svuotare la vescica mediante aspirazione e iniettare 150 μl di PBS contenente cellule MB49 (intervallo 0,5 × 105 - 0,5 × 106) nella vescica. Lasciare la siringa assemblata al catetere per evitare la fuoriuscita di cellule. È meglio fissare la siringa fissandola al tampone con dello scotch.
- Dopo 1 ora, estrarre delicatamente il catetere dall'uretra e posizionare i topi nella gabbia sotto una lampada a incandescenza fino al risveglio: questo di solito avviene tra 1 e 2 ore dopo la fine del trattamento.
4. Somministrazione intravescicale della proteina attivante i neutrofili Helicobacter pylori (HP-NAP)
- NOTA: Almeno 3 giorni dopo l'instillazione cellulare, è possibile iniziare il trattamento.
- Cateterizzare come descritto nei passaggi da 3.1 a 3.4. In questa fase, non è necessario bruciare la parete della vescica con HCl.
- Utilizzando una siringa da 1 ml, lavare la vescica dall'urina residua iniettando 200-300 μl di PBS sterile e aspirare tutto il liquido dalla vescica.
- Iniettare 50 μg di HP-NAP per 150 μl di PBS nella camera d'aria. Lasciare la siringa attaccata al catetere per evitare la fuoriuscita della soluzione proteica. Fissare la siringa fissandola al tampone con dello scotch.
- Dopo 1 ora, estrarre delicatamente il catetere dall'uretra e posizionare i topi nella gabbia sotto una lampada a incandescenza fino al risveglio.
