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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal locale
comitato istituzionale per la cura degli animali e il comitato di revisione veterinaria JoVE. Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Generazione di cellule T CD8+ virali Ag-specifiche da iPSC (cellule T iPSC-CD8+)
- Creazione dei costrutti retrovirali
nota: I geni α e β del recettore delle cellule T (TCR) sono collegati alla sequenza di autoscissione 2A. Il vettore retrovirale MSCV-IRES-DsRed (MiDR) è DsRed+.
- Subclonare i geni TCR ibridi umano-murino specifici per HBs183-191 (FLLTRILTI) (Vα34 e Vβ28) nel MiDR per creare il costrutto MiDR s183 (Figura 1A).
- Trasduzione retrovirale
NOTA: Le cellule Platinum-E (Plat-E) sono utilizzate per il confezionamento dei retrovirus (che trasportano i geni TCR s183), che verranno utilizzati per la trasduzione retrovirale. Le cellule Plat-E sono efficaci cellule di imballaggio dei retrovirus alla base delle cellule 293T, che sono state sviluppate per mezzo di costrutti di imballaggio unici tramite il promotore EF1α per esprimere proteine della struttura retrovirale, tra cui gag, pol ed env ecotropico.
- Su una piastra di coltura da 100 mm, seminare 3 x 106 cellule Plat-E in 8 mL di terreno di coltura DMEM contenente il 10% di siero fetale di vitello (FCS) in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2, 1 giorno prima della trasfezione.
- Il giorno 0, trasfettare il costrutto MiDR s183 nelle cellule Plat-E utilizzando un reagente di trasfezione del DNA.
- Il giorno 1, seminare 1 x 106 iPSC (proteina fluorescente verde [GFP]+) in una piastra di coltura pre-rivestita di gelatina.
- Nei giorni 2-3, raccogliere il surnatante contenente retrovirus dalla coltura cellulare Plat-E per trasdurre le iPSC con il TCR s183 in presenza di una soluzione di 1,6-dibromoesano.
- Il giorno 4, tripsinizzare le iPSC trasdotte dal gene s183 TCR, centrifugare a 400 x g per 5 minuti e seminare 3 × 105 iPSC in una piastra di coltura da 100 mm pre-rivestita con 3 x 106 cellule feeder SNL76/7 (irSNL76/7) irradiate.
- Il giorno 5 o 6 di confluenza, tripsinizzare le cellule, centrifugare a 400 x g per 5 minuti e procedere per la selezione delle cellule. Gating su cellule vive, selezionare le cellule doppie positive GFP e DsRED (le iPSC trasdotte dal gene s183 TCR) utilizzando un selezionatore cellulare ad alta velocità. Analogamente al passaggio 1.2.5, co-coltura delle cellule selezionate su cellule feeder irSNL76/7 per un uso futuro.
- Differenziamento delle cellule T iPSC-CD8+ HBV-specifiche
NOTA: Le cellule stromali OP9-DL1/DL4 sovraesprimono entrambi i ligandi di Notch DL1 e DL4, e la co-coltura di iPSC con le iPSC può promuovere la differenziazione delle cellule T mediata dalla segnalazione di Notch.
- Coltivare iPSC trasdotte dal gene s183 TCR (s183/iPSC) nel monostrato cellulare OP9-DL1-DL4 in terreni MEM (α-minimum essential medium) contenenti il 20% di siero fetale bovino (FBS). Includere il ligando della tirosin-chinasi 3 (Flt3) murina FMS-like (mFlt-3L; concentrazione finale = 5 ng/mL) nella coltura.
- Il giorno 0, seminare 0,5-1,0 x 105 S183/iPSC in una piastra di coltura di 10 cm precedentemente coltivata con cellule OP9-DL1-DL4. Verificare che le celle OP9-DL1-DL4 siano in una condizione di confluenza dell'80%-90%.
- Il giorno 5, sciacquare le iPSC con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), aspirare la PBS, aggiungerla a 4 mL di tripsina allo 0,25% e incubare in un'incubatrice a 37 °C per 10 minuti. Successivamente, aggiungere altri 8 mL di terreno iPSC per terminare la digestione della tripsina. Accumulare tutte le soluzioni digestive contenenti le cellule e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 15-30 °C.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di terreno iPSC. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra di Petri da 10 cm e incubare in un'incubatrice per 30 minuti a 37 °C.
- Dopo 30 minuti, raccogliere il terreno iPSC contenente le celle galleggianti. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm e calcolare il numero di cellule.
- Seminare 5 x 105 cellule nella piastra di coltura Cellule OP9-DL1-DL4 precedentemente coltivate con una condizione di confluente dell'80%-90%, come descritto al punto 1.3.1.
nota: Per il differenziamento delle cellule T, ogni 2-3 giorni, le cellule derivate da iPSC devono essere riseminate con un nuovo strato di cellule OP9-DL1-DL4.
- valutazione
- Cambiamenti morfologici delle iPSC differenzianti
- Osserva le cellule al microscopio in vari giorni.
nota: Entro il quinto giorno, le colonie hanno caratteristiche simili a quelle del mesoderma, esibendo una classica morfologia a forma di fuso simile ai fibroblasti dermici umani e una crescita sostenuta in vitro. Entro l'ottavo giorno, iniziano ad apparire piccoli gruppi rotondi di cellule.
- Analisi delle iPSC differenzianti mediante citometria a flusso
- Nei vari giorni di co-coltura, analizzare le cellule derivate da iPSC come descritto in precedenza (Figura 1B, C).
- Analisi funzionale di iPSC differenzianti
- Il 28° giorno di co-coltura, raccogliere le cellule T iPSC-CD8+ dalle colture raccogliendo le cellule galleggianti, tripsinizzare le cellule rimanenti con lo 0,25% di tripsina, risospendere in 8 mL di terreno iPSC, centrifugare per 5 minuti a 400 x g a 15-30 °C, rimuovere il terreno, quindi risospendere le cellule in 10 mL di terreno.
- Conservare le cellule risospese in un piatto fresco di 10 cm in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti e assemblare le cellule galleggianti. Quindi sciacquare le celle una volta con un PBS freddo.
- Incubare 3 x 10 6 splenociti impoveriti di cellule T (CD4-CD8-) da milze di topi HLA-A2.1-transgenici (HHD) HLA-A2.1-transgenici (HHD) knockout H-2 di classe I con 5 μM di peptide s183 (FLLTRILTI) in 200 μL di terreno a 4 °C per 30 minuti.
- Produrre una miscela di cellule T iPSC-CD8+ con splenociti pulsati con peptide s183 (cellule T: splenociti = 1:4; utilizzare 0,75 x 106 cellule T). Incubare la miscela di cellule a 37 °C in un incubatore di CO2 per 40 ore. Durante le ultime 7 ore, aggiungere 4 μL di brefeldina A diluita nella coltura (concentrazione finale di 1.000x, che sarà diluita in terreno di coltura 1x) per bloccare i processi di trasporto durante l'attivazione cellulare.
- Colorare le cellule ed eseguire l'analisi citofluorimetrica dell'interferone-gamma intracellulare (IFN-γ) come descritto in precedenza (Figura 2).
2. Induzione della replicazione dell'HBV attraverso la somministrazione idrodinamica del plasmide dell'HBV
NOTA: il costrutto pAAV/HBV1.2 è stato generato come descritto in precedenza. Il DNA completo dell'HBV 1.2 è incorporato nel vettore pAAV.
- Consegne idrodinamiche di plasmidi HBV attraverso la vena caudale
- Riscaldare i topi HHD utilizzando una lampada riscaldante per 5 minuti nella gabbia per dilatare la vena caudale.
- Trattenere l'animale per mezzo di un sistema di contenzione e pulire le code di topo con spray all'etanolo al 70%.
- Consegna di plasmidi nel fegato.
- Misura il peso corporeo del mouse utilizzando una bilancia di misurazione.
- Diluire 10 μg di plasmide HBV nell'equivalente dell'8% della massa corporea PBS (ad esempio, 1,6 ml per un topo da 20 g). Caricare il plasmide diluito in una siringa da 3 ml con un ago ipodermico da 26 G × 1⁄2" (0,45 × 12 mm).
- Individua una delle due vene laterali della coda nel terzo medio della coda e posiziona l'ago in una delle vene laterali. Somministrare l'iniezione contenente il plasmide HBV attraverso la vena caudale entro 3 - 5 s.
- Quantificazione della viremia da siero di sangue di topi infetti
nota: La replicazione dell'HBV avviene dal giorno 3 al 35 nel siero di topo. La replicazione del DNA raggiunge il picco il giorno 7 e si riduce gradualmente. L'HBV DNA non viene eliminato dal siero fino al giorno 35.
- Raccolta del siero di sangue da topi infetti
- Raccogliere circa 0,1 ml di sangue in una provetta da microcentrifuga da ciascun topo 3, 5, 7 e 10 giorni dopo l'infezione mediante sanguinamento retroorbitale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, quindi incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti.
- Centrifugare il campione a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante sierico dopo la centrifugazione.
- Purificare il DNA dal siero del sangue utilizzando un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio seguendo le raccomandazioni del produttore. In breve, lisare le cellule in una colonna a base di silice, eseguire i lavaggi ed estrarre il DNA aggiungendo etanolo al 100% alla colonna di eluizione e centrifugando a 6000 x g per 1 minuto. Eluire il DNA in 50 μL di acqua priva di RNasi.
- Utilizzare 100 ng di HBV DNA dall'eluizione per l'analisi PCR in tempo reale. Utilizzare i seguenti inneschi e sonde: avanti 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; rovescio 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- Utilizzare il genoma dell'HBV contenente il plasmide (pAAV/HBV1.2) per la curva standard ed eseguire la PCR in tempo reale in un volume totale di 10 μl (Figura 3).
- Impostare la reazione PCR in un volume totale di 10 μl, come mostrato nella Tabella 1.
- Impostare il programma PCR nel termociclatore, come mostrato nella Tabella 2. La velocità di transizione della temperatura programmata è di 20 °C/s per la denaturazione/ricottura e di 5 °C/s per l'estensione. Misura la fluorescenza alla fine della fase di ricottura per ogni ciclo per il monitoraggio PCR in tempo reale.
3. Riduzione della replicazione dell'HBV mediante ACT di cellule T iPSC-CD8+ virali Ag-specifiche
- Trasferimento cellulare adottivo (ACT)
- Differenziare le s183/iPSC (1.3.7) sulle cellule stromali OP9-DL1-DL4 in presenza di mFlt-3L e mIL-7 per 8 giorni, come descritto nel paragrafo 1.3.
- Il giorno 22, raccogliere le cellule T iPSC-CD8+ dalla piastra da 10 cm con tripsina, quindi lavare e risospendere ogni piastra da 10 cm in 10 mL di terreno fresco. Aggiungere le cellule a una piastra fresca di 10 cm e rimetterle nell'incubatrice per 30 minuti, come fatto nel paragrafo 1.3. Dopo 30 minuti, raccogli le celle galleggianti.
- Utilizzare un colino di nylon da 70 μm per far passare le celle per eliminare i cluster di cellule e contare il numero di cellule. Adattare le cellule a una concentrazione di 1,5 x 107 cellule/mL in soluzione di PBS fredda e utilizzare un colino di nylon da 70 μm per far passare le cellule ed eliminare nuovamente i cluster cellulari, se necessario. Mantenere le cellule sul ghiaccio fino all'ACT.
- Iniettare 200 μL di sospensione cellulare (3 x 106 cellule) in topi HHD di 4-6 settimane attraverso la vena caudale.
- Induzione della replicazione dell'HBV
- Il giorno 14 dopo il trasferimento cellulare, eseguire la somministrazione idrodinamica del plasmide HBV attraverso la vena caudale come descritto nel paragrafo 2.1.
Tabella 1: Volume di reazione alla PCR
| Modello di DNA | 2 ml |
| Miscela di ibridazione master del DNA (Taq DNA polimerasi, tampone di reazione PCR, 10 mM di MgCl2 e miscela dNTP) | 1 ml |
| 25 mM di MgCl2 | Flacone da 0,8 ml |
| 0,3 μM la sonda | 3 ml |
| 5 μM di ciascun primer | Flacone da 3,2 ml |
| totale | Confezione da 10 ml |
Tabella 2: Programma PCR
| denaturazione | Temperatura
95 °C | Tempo
5 secondi |
| ricottura | 53 °C | 10 secondi |
| estensione | 72 °C | 20 secondi |
| 5 °C | |
