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Soppressione della replicazione del virus dell'epatite B utilizzando cellule T virali antigene-specifiche

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

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Fonte: Xiong, X., et al. I linfociti T virali Ag-specifici derivati da cellule staminali sopprimono la replicazione dell'HBV nei topi. J. Vis. Exp. (2019).

Il video mostra un test che utilizza cellule T CD8+ derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) per inibire la replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi. Queste cellule T, ingegnerizzate con recettori HBV-specifici, vengono trasferite in topi transgenici. I plasmidi del genoma dell'HBV competenti per la replicazione vengono quindi iniettati direttamente nel fegato, consentendo l'assorbimento del DNA virale. Una volta che gli antigeni virali sono espressi e presentati da molecole ibride MHC-I, le cellule T ingegnerizzate riconoscono e si legano a questi complessi. Ciò innesca il rilascio di molecole citotossiche, con conseguente distruzione delle cellule epatiche infette da HBV e soppressione della replicazione virale.

Protocol

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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal locale
comitato istituzionale per la cura degli animali e il comitato di revisione veterinaria JoVE. Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Generazione di cellule T CD8+ virali Ag-specifiche da iPSC (cellule T iPSC-CD8+)

  1. Creazione dei costrutti retrovirali
    nota: I geni α e β del recettore delle cellule T (TCR) sono collegati alla sequenza di autoscissione 2A. Il vettore retrovirale MSCV-IRES-Ds....

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Results

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Figura 1: Generazione di cellule T iPSC-CD8+ Ag-specifiche virali dell'HBV.

Le iPSC di topo sono trasdotte con i seguenti costrutti retrovirali: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) o OVA257–264 TCR (MiDR-OVA TCR), e le iPSC trasdotte sono co-coltivate con cellule stromali OP9-DL1/DL4 per la differenziazione della linea T. (A) Rappresentazione schematica del costrutto .......

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Disclosures

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Topi HHDInstitut Pasteur, Parigi, FranciaTopi H-2 classe I knockout, HLA-A2.1-transgenici (HHD)
iPS-MEF-Ng-20D-17Banca di cellule RIKENAPS0001
SNL76/7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCodice CRL-2749
plasmide pAAV/HBV1.2Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Ospedale Universitario Nazionale di Taiwan, Taiwan)Costrutto di DNA HBV
Geni TCR specifici per HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)Dott. Adam J Gehring (Istituto di ricerca del Toronto General Hospital, Toronto, Canada)Geni TCR ibridi uomo-murino ristretti A2-specifici per FLLTRILTI (Vα34 e Vβ28)
Geni TCR specifici per gli OOVA257-264Dott. Dario A. Vignali (Università di Pittsburgh, PA)Geni TCR H-2Kb-ristretti specifici per SIINFEKL
Anticorpo anti-CD3 (17A2)Bioleggenda100236
Anticorpo anti-CD44 (IM7)BD Pharmingen103012
Anticorpo anti-CD4 (GK1.5)Bioleggenda100408
Anticorpo anti-CD8 (53-6,7)Bioleggenda100732
Anticorpo anti-IFN-γ (XMG1.2)BioleggendaCodice: 505810
Anticorpo anti-TNF-a (MP6-XT22)Bioleggenda506306
α-MEMInvitrogenCodice A10490-01
Anticorpo anti-HBsThermo FisherMA5-13059
ACK Tampone di lisiLonza10-548E
Brefeldin AsigmaB7651
DMEMInvitrogenABCD1234
FBSCloneSH3007.01
Selezionatore cellulare FACSAria FusionBdCodice 656700
gelatinaMilliporeSigmaG9391
Gene JammerAgilentCodice 204130
Pentamero HLA-A201-HBs183-91-PEProimmuneF027-4A - 27
Anticorpo secondario anti-topo HRPInvitrogenCodice A27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7Peprotech217-17
Nucleasi S7Roche10107921001
ParaformaldeideMilliporeSigmaP6148-500GAttenzione: allergenico, cancerogeno, tossico
Tampone di permeabilizzazioneBioleggenda421002
PolibreneMilliporeSigma107689
Montante antisbiadimento ProLong™ Gold con DAPIInvitrogenP36931
Kit di spin del virus QIAamp MinEluteQiagenCodice: 57704

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Tags

Hepatitis B VirusViral Antigen Specific T CellsiPSC Derived CD8 T CellsHydrodynamic Plasmid DeliveryHBV Genome PlasmidsTail Vein InjectionAntigen Presenting MoleculesCytotoxic Molecule ReleaseHBV Infected Liver CellsViral Replication Suppression

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