Una terapia cellulare per l'artrite autoimmune in un modello murino

Abstract

Fonte: Haque, M. et al., Sviluppo di cellule T regolatorie antigene-specifiche derivate da cellule staminali contro l'autoimmunità.J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra una terapia cellulare per l'artrite autoimmune nei topi. Le cellule T regolatorie derivate da iPSC che esprimono recettori specifici per l'ovoalbumina vengono iniettate con albumina sierica bovina metilata (mBSA) emulsionata in un adiuvante. Le cellule presentanti l'antigene (APC) murino elaborano e presentano l'mBSA alle cellule T, provocando l'attivazione e la migrazione delle cellule T verso la membrana sinoviale dell'articolazione del ginocchio. Le iniezioni successive coinvolgono mBSA da solo nel ginocchio sinistro e una combinazione di mBSA e ovoalbumina nel ginocchio destro. Nel ginocchio sinistro, la risposta immunitaria all'mBSA scatena l'artrite, mentre nel ginocchio destro, le cellule T-regolatorie che interagiscono con l'ovoalbumina mitigano l'infiammazione, migliorando i sintomi dell'artrite.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Maturazione in vivo e soppressione dell'artrite autoimmune

1. Generare i costrutti da utilizzare nella trasduzione retrovirale subclonando i geni del recettore delle cellule T OT-II (TCR) e la proteina 3 forkhead box (FoxP3) nel plasmide MiDR legato al peptide 2A auto-scisso per creare il costrutto MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Eseguire la trasduzione retrovirale di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando le cellule Plat E come linea cellulare di confezionamento.
3. Differenziazione in vivo e induzione dell'artrite nei topi.
   1. Differenziare le iPSC trasdotte OT-II TCR/FoxP3 (OT-II-FoxP3/iPSCs), le iPSC trasdotte FoxP3 e le iPSC trasdotte DsRed sulle cellule stromali OP9-DL1-DL4-I-A^b in presenza di citochine mFlt-3L e mIL-7 per 8 giorni.
   2. Il giorno 0, seminare le cellule^b OP9-DL1-DL4-I-A a una densità minima di 10⁴ cellule/cm² utilizzando terreni OP-9 (terreni α-MEM contenenti il 20% di siero fetale di vitello (FCS) e 2,2 g/L di bicarbonato di sodio. Piastra 1 x 10⁶ celle per piatto da 10 cm.
   3. Il giorno 3, quando le cellule^b OP9-DL1-DL4-I-A diventano confluenti all'80-90%, rimuovere il terreno e seminare 0,5 - 1 x 10⁵ iPSC su cellule b OP9-DL1-DL4--I-Aⁱⁿ OP-9 media.
      NOTA: Questo stabilisce la co-coltura di iPSC su cellule^b OP9-DL1-DL4-I-A ed è considerato il giorno 0 di differenziazione.
   4. Il 5° giorno, rimuovere il terreno dal piatto da 10 cm mediante aspirazione, lavare le cellule con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x e aspirare il PBS. Aggiungere 4 ml di tripsina allo 0,25% e incubare a 37 °C per 10 min. Aggiungere altri 8 ml di terreno iPSC alle cellule, rimetterle in sospensione e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
      1. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di terreno iPSC. Incubare queste cellule risospese su un piatto fresco di 10 cm e rimetterle nell'incubatrice per 30 min.
         NOTA: Rimuovere le celle di alimentazione OP9-DL1-DL4-I-A^b e mantenere le iPSC differenzianti nel terreno. Mantenere continuamente le cellule^b OP9-DL1-DL4-I-A per raggiungere una confluenza dell'80-90% per un'ulteriore co-coltura.
      2. Dopo 30 minuti, raccogliere le cellule galleggianti, filtrarle attraverso un colino cellulare da 70 μm e contarle con un emocitometro.
   5. Seminare 5 x 10⁵ di iPSC in un fresco 80-90% confluente di cellule OP9-DL1-DL4-I-A^b in terreno OP9. Integrare il terreno con mFlt-3L a una concentrazione finale di 5 ng/ml.
   6. Tripsinizzare tutti e tre i tipi di cellule dalla piastra da 10 cm e risospendere le cellule da ciascuna piastra da 10 cm in 10 ml di terreno fresco. Aggiungere le cellule in una piastra fresca da 10 cm e rimettere nell'incubatrice per 30 minuti. Dopo 30 minuti, raccogli le celle galleggianti.
   7. Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere i cluster cellulari e contare utilizzando un emocitometro. Regolare le cellule a una concentrazione di 1,5 x 10⁷ cellule/ml in PBS freddo e filtrare nuovamente se necessario. Mantenere le cellule sul ghiaccio fino al trasferimento delle cellule adottive nei topi.
   8. Iniettare 200 μl della sospensione cellulare (3 x 10⁶ cellule) in tre diversi gruppi di topi femmina C57BL/6 di 4 - 6 settimane attraverso la vena caudale.
   9. Il giorno 10, dopo il trasferimento cellulare, iniettare nei topi 100 μg di albumina sierica bovina metilata (mBSA) emulsionata nell'adiuvante completo di Freund alla base della coda utilizzando una siringa da 1 ml.
   10. Il giorno 17, anestetizzare i topi usando un vaporizzatore di isoflurano. Utilizzare il 4-5% di isoflurano per l'induzione e l'1-2% per il mantenimento. Indurre l'artrite mediante iniezione intra-articolare di 20 μg di mBSA in 10 μl di PBS nell'articolazione del ginocchio sinistro e di 20 μg di mBSA e 100 μg di ovoalbumina intera (OVA) in 10 μl di PBS nell'articolazione del ginocchio destro. Il cibo e un impacco di gel possono essere posizionati sul pavimento della lettiera dopo che l'artrite si è sviluppata. I topi saranno soppressi: Body Condition Score (BCS) di 2/5 o moribondo, grave cachessia e/o decubito persistente (un periodo di 24 ore) e punteggio di gravità di 4. Nel punteggio 4, eritema e grave gonfiore avvolgono la caviglia, piede e dita, o anchilosi dell'arto.
4. Caratterizzazione delle iPSC trasdotte OT-II TCR/FoxP3.
   1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza (20X) per visualizzare le cellule DsRed⁺ GFP⁺ vive non fissate.
   2. Esaminare l'integrazione e l'espressione genica mediante Western blot e citometria a flusso.
5. Dosaggio della soppressione dell'artrite
   1. Misurare il gonfiore di entrambe le ginocchia dei topi prima dell'induzione dell'artrite utilizzando un calibro a quadrante per stabilire una linea di base.
   2. Seguire i passaggi (1.3.1 - 1.3.10) per l'induzione dell'artrite e il trasferimento delle Treg. Misura le ginocchia del mouse con un calibro a quadrante dopo il trasferimento Treg.
   3. Calcola l'aumento percentuale del diametro del ginocchio: Aumento percentuale = (Diametro del ginocchio il giorno 1 - Diametro del ginocchio il giorno 0) / Diametro del ginocchio il giorno 0.
6. Misurazione della distruzione articolare e dell'infiltrazione di cellule infiammatorie nelle ginocchia mediante istologia (Figura 1).
   1. Il 7° giorno dopo l'induzione dell'artrite, sopprimere i topi mediante inalazione di anidride carbonica (CO₂) seguita da lussazione cervicale. Rimuovere i peli dalle ginocchia con un tagliacapelli elettrico e asportare le ginocchia con una procedura chirurgica.
   2. Rimuovere la pelle dalle zampe praticando un'incisione nella zampa posteriore con le forbici smussate e tagliare la pelle attraverso la coscia e fino alla caviglia. Sbucciare delicatamente la pelle sulla gamba e sul piede per esporre il muscolo. Rimuovere il muscolo dalla gamba con cautela senza danneggiare l'articolazione del ginocchio.
      1. Taglia la zampa posteriore appena sopra l'articolazione pelvica/anca e taglia la tibia usando forbici da dissezione affilate.
   3. Fissare le ginocchia in formalina al 4% per 48 ore. Decalcificare le ginocchia utilizzando acido formico 2,5 M; sciacquare tre volte in xilene per 3 minuti, risciacquare due volte in etanolo al 100%, risciacquare due volte in etanolo al 95%, sciacquare due volte in acqua deionizzata per 2 minuti e decalcificare in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) da 1 mM. Trattare a una temperatura inferiore all'ebollizione (90 °C) per 20 min.
   4. Rimuovere entrambe le ginocchia, fissare in formalina al 10% e calcificare in Formical-4. Incorporare i tessuti in paraffina, sezione a 4 μm, e colorare con ematossilina ed eosina (H & E) o colorazione con Safranina O e osservare al microscopio.

Risultati

Figura 1: Il trasferimento adottivo di iPSC-Treg Ag-specifici migliora l'AIA nei topi. Le iPSC murine sono state trasdotte con il costrutto retrovirale MiDR, MiDR-FoxP3 o MiDR-TCR-FoxP3 e sono state co-coltivate sulle cellule^b OP9-DL1/DL4/I-A. Il giorno 7, le cellule trasdotte dal gene (3 × 10⁶/topo) sono state trasferite adottivamente in topi femmina C57BL/6 in...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mouse C57BL/6j	Laboratorio Jackson	664
α-MEM	Invitrogen	Codice A10490-01
FBS	Clone	SH3007.01
Polibrene	sigma	107689
Genejammer	Scienza integrata	Codice 204130
mFlt-3L	PEPROTECH	250-31L
mIL-7	PEPROTECH	217-17
mBSA	sigma	Codice: A7906
Albumina di ovuli	Avantor	Codice 0440-01
Cfa	Difco	2017014
Fermacorda per fune di coda	Braintree scientifico	RTV 150-STD
Paraformaldeide	sigma	P6148-500G	Attenzione: allergenico, cancerogeno, Tossico