Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Splenectomia e preparazione delle cellule T
Giorno 0:
- Versare 10 ml di terreno di coltura a cellule T (MTC) in un conico da 50 ml e metterlo su ghiaccio per la raccolta della milza.
- Sacrificare il numero appropriato di animali mediante asfissia da CO2 e decapitazione secondaria: Mettere gli animali in una gabbia che riceve CO2 a una velocità di flusso del 10-30% del volume della gabbia/minuto, secondo le linee guida dell'American Veterinary Medical Association (non più di 5 animali possono essere sacrificati contemporaneamente) fino al termine della respirazione e per due minuti successivi. Rimuovi gli animali dalla camera di CO2 e decapitali.
nota: Una milza di un topo femmina C57BL/6 di 6-12 settimane produrrà circa 4,5-5 x 107 splenociti. Qui verranno prelevate 4 milze per circa 200 x 106 cellule.
- Appoggiare il mouse in modo che il lato destro sia rivolto verso l'alto e spruzzare con etanolo al 70%. Con la pinza, afferra una sottile piega di pelle sotto la gabbia toracica sinistra e incidi leggermente con le forbici. Staccare la pelle, afferrare con cura una piega sottile del peritoneo con una pinza e tagliare una piccola cavità.
- La milza è un piccolo organo allungato di colore rosso scuro che assomiglia a un fagiolo appiattito; afferrare delicatamente la milza con la pinza e asportare tagliando via il tessuto connettivo circostante. Mettere le milze asportate nel conico contenente 10 ml di MTC con ghiaccio.
- Versare la milza su un colino cellulare a maglie da 70 μm e disaggregare schiacciando con l'estremità smussata dell'interno di una siringa da 5 ml per generare una sospensione unicellulare. Per ogni colino a maglie devono essere disaggregate al massimo due milze.
- Utilizzare un piccolo volume di MTC per lavare accuratamente il colino dopo la disaggregazione per raccogliere eventuali splenociti rimanenti. Raggruppare tutte le milze disaggregate in una sospensione unicellulare. Portare il volume finale a 50 ml con MTC per un lavaggio e centrifugare a 300 x g per 10 minuti.
- Preparare una soluzione di 1x tampone di lisi aggiungendo 5 ml di tampone di lisi 10x a 45 ml di acqua sterile. Per eliminare i globuli rossi, risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lisi 1x per milza in un conico da 50 ml, mescolando bene pipettando delicatamente su e giù. Se si superano i 5 milza, utilizzare una provetta da centrifuga da 250 ml. Mettere la provetta conica o da centrifuga a bagnomaria a 37 °C per 5 minuti.
- Rimuovere la reazione di lisi dal bagno d'acqua e aggiungere MTC in rapporto 1:1 con tampone di lisi per neutralizzare la reazione. Lavare centrifugando a 300 x g per 10 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere completamente il pellet in MTC (2 ml/milza, 8 ml in totale per 4 milza) pipettando su e giù.
- Contare le cellule aggiungendo 10 μl di sospensione cellulare a 190 μl di blu di tripano (diluizione 1:20). Moltiplicare il numero ottenuto in uno dei quattro quadrati grigliati per 20 x 104 x volume totale (8 ml) per ottenere il numero totale di cellule (ad esempio, 125 cellule x 20 x 104 x 8 ml = 200 x 106 splenociti).
- Diluire le cellule a una concentrazione di 2 x 106 cellule/ml in MTC, integrato con 2 μg/ml di concanavalina A (ConA) e 50 UI/ml di interleuchina-2 umana ricombinante (rhIL-2). Pertanto, per 200 x 106 splenociti, aggiungere 92 ml di terreno a 8 ml di cellule, 200 μg di ConA e 5.000 UI di rhIL-2.
- Aggiungere 2 mL di cellule a ciascun pozzetto di piastre trattate con coltura tissutale da 24 pozzetti, in modo tale che in ogni pozzetto siano presenti 4 x 106 cellule (ad esempio, 100 ml di cellule richiederanno circa 4 piastre).
- Incubare per una notte a 37 °C con CO2 al 5%.
2. Trasduzione
Giorno 1:
- Calcolare il numero di piastre a 24 pozzetti non trattate con coltura tissutale necessarie per la trasduzione moltiplicando per 2 il numero di milze prelevate (sono necessarie 8 piastre per 4 milze).
- Successivamente, calcolare il volume richiesto di soluzione di frammento di fibronectina umana ricombinante (RHFF) necessaria per rivestire le piastre moltiplicando (numero totale di pozzetti + 3) x 0,5 ml (8 piastre x 24 pozzetti = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
- Preparare 97,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente RHFF a una concentrazione di 25 μg/ml moltiplicando il volume totale per 25 μg (97,5 x 25 = 2437,5 μg). Aggiungere questa quantità di RHFF a 97,5 ml di PBS.
- Rivestire le piastre a 24 pozzetti trattate con colture non tissutali aggiungendo 0,5 ml di soluzione PBS/RHFF per pozzetto.
- Incubare per una notte a 4 °C.
Giorno 2:
- Scaricare la soluzione PBS/RHFF da piastre a 24 pozzetti trattate con colture non tissutali.
- Aggiungere 1 ml/pozzetto di albumina sierica bovina (BSA) in PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Rimuovere BSA capovolgendo saldamente la piastra. Lavare aggiungendo 2 ml di PBS.
- Raccogliere il surnatante virale trasferendo i terreni da ciascuna piastra rivestita di 293T (HEK293T)-poli-D-lisina (PDL) del rene embrionale umano in una provetta da centrifuga da 250 ml e centrifugare per 10 minuti a 500 x g.
- Trasferire con cura il surnatante virale in una provetta da centrifuga fresca da 250 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare che potrebbe essersi formato.
- Aggiungere TCM fresco al surnatante virale in modo tale che il volume finale sia di 3 ml in più rispetto alla quantità necessaria per i pozzetti rivestiti di RHFF. Ad esempio, per 192 pozzetti rivestiti di RHFF, portare il volume del surnatante virale a 192 + 3 ml = 195 ml.
- Rimuovere gli splenociti in coltura dall'incubatore e risospendere pipettandoli delicatamente su e giù 2-3 volte in ciascun pozzetto. Trasferire in un conico da 250 ml. Se si utilizza una pipetta multicanale, l'utilizzo di un serbatoio sterile prima del trasferimento aiuterà ad accelerare questa fase. Contare come descritto in precedenza e centrifugare a 300 x g per 10 min.
- Aggiungere l'interleuchina-2 umana ricombinante (rhIL-2) al surnatante virale a una concentrazione di 50 UI/ml. Ad esempio, aggiungere 50 x 195 = 9.750 UI di rhIL-2 a 195 ml di surnatante virale.
- Risospendere gli splenociti nel surnatante virale a 1 x 106 cellule/ml
- Aggiungere 1 ml/pozzetto di sospensione di splenociti alle piastre a 24 pozzetti rivestite di RHFF.
- Centrifugare per 90 min secondo le seguenti impostazioni: 770 x g, accelerazione = 4, frenata/decelerazione = 0, 32 °C.
- Preparare una soluzione di MTC con 50 UI/ml di rhIL-2. Ad esempio, preparare una soluzione da 200 MTC aggiungendo 10.000 UI di rhIL-2. Aggiungere 1 ml di rhIL-2/TCM in ciascun pozzetto dopo la centrifugazione.
- Coltura notturna a 37 °C al 5% di CO2.
3. Coltura e raccolta di cellule CAR T
Giorni 3 e 4:
- Se le cellule T raggiungono >80% di confluenza, le cellule possono essere divise (questo di solito si verifica entro il giorno 3 o il giorno 4). Per dividere le cellule, pipettare delicatamente su e giù in ciascun pozzetto 2-3 volte e spostare 1 ml da ciascun pozzetto in nuovi pozzetti di una piastra fresca trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti. Quindi, aggiungere 1 ml di MTC fresco con 50 UI/ml di IL-2 in ciascun pozzetto in modo che il volume finale sia di 2 ml in tutti i pozzetti.
- Se le cellule non raggiungono la confluenza >80%, eseguire una sostituzione a metà del terreno pipettando lentamente 1 ml di terreno dalla parte superiore di ciascun pozzetto. Evitare di disturbare le celle depositate sul fondo durante la rimozione dei terreni. Aggiungere 1 ml di MTC fresco contenente 50 UI/ml di rhIL-2.
Giorno 5:
- Risospendere le cellule CAR T pipettandole delicatamente su e giù 3 volte in ciascun pozzetto e trasferirle in una provetta da centrifuga da 250 ml. Centrifugare le celle a 300 x g per 10 min.
- Aspirare completamente il surnatante senza disturbare il pellet. Lavare una volta con PBS, contare le cellule come descritto in precedenza e lavare con PBS una seconda volta. Una resa tipica delle cellule T CAR è di circa 1 x 106 celle per pozzetto (8 piastre x 24 pozzetti = 192 x 106 cellule T CAR).
- Risospendere le cellule in PBS a una concentrazione di 5 x 107/ml per un'iniezione di 1 x 107 in un volume di 200 μg (ad esempio, per 192 x 106 cellule CAR T, risospendere il pellet lavato in 3,84 ml di PBS).
