Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto. Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Espansione non specifica dei linfociti T effettori citotossici
- Preparare e irradiare le celle di alimentazione a 35 Gy. Per la stimolazione di 2 x 105 - 4 x 105 cellule effettrici, preparare 10 x 106 cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e 1 x 106 linee cellulari linfoblastoidi B (BLCL) da tre donatori sani e distinti.
- Risospendere sia le cellule feeder che le cellule effettrici in 15 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrati con il 10% di siero fetale di vitello inattivato termicamente (FCS), 2 mM di L-glutammina, penicillina (100 UI/mL) e streptomicina (0,1 μg/mL) e 300 UI/mL di interleuchina-2 ricombinante (IL-2).
- Aggiungere fitoemoagglutinina (PHA-L) a una concentrazione finale di 1 μg/mL, mescolare accuratamente e distribuire 150 μl di sospensione cellulare per pozzetto in piastre con fondo a U a 96 pozzetti.
- Incubare a 37 °C e con il 5% di CO2 in atmosfera umidificata.
- Controllare quotidianamente la piastra fino a quando non si formano grandi grumi di cellule nei pozzetti di coltura (~giorno 7).
- Trasferire le cellule in un pallone di coltura a 1 x 106 cellule/mL in terreno di coltura fresco.
- Determinare il numero totale di cellule mediante conteggio (2 volte a settimana) e mantenerle a 1 x 106 cellule/mL in terreno di coltura fresco.
nota: Le cellule immunitarie effettrici devono essere pronte per la somministrazione terapeutica in uno stato di riposo (di solito 3 settimane dopo lo stimolo iniziale di amplificazione). La purezza e la reattività di queste cellule effettrici devono essere controllate prima delle iniezioni in vivo (ad esempio, con saggi in vitro).
2. Preparazione delle cellule effettrici preoperatorie
- Dopo aver controllato la conta delle cellule effettrici, raccogliere le cellule effettrici in una provetta da 50 mL mediante centrifugazione (300 x g per 5 minuti).
nota: Per compensare eventuali perdite, preparare un eccesso di celle (ad esempio, 50 x 106).
- Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule in 15 mL di PBS sterile e centrifugare per 5 minuti a 300 x g per eseguire il lavaggio.
- Rimuovere con cautela e completamente il surnatante e quindi risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS sterile.
- Trasferire le cellule risospese in una microprovetta da 1,5 mL per la centrifugazione a 300 x g per 5 minuti.
- Rimuovere con cautela e completamente il surnatante pipettandolo lentamente.
- Risospendere il pellet cellulare in 8 μL di PBS sterile per topo.
nota: Questo è un passaggio fondamentale.
- Misurare il volume della sospensione cellulare utilizzando una micropipetta. Se necessario, aggiungere PBS sterile (20 x 106 cellule in 15 μL di PBS per dose) e mescolare accuratamente.
- Verificare, utilizzando una micropipetta, che il volume finale per topo sia compreso tra 15 e 20 μL (imperativamente < 20 μL).
- Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione stereotassica.
nota: Non sono stati testati più di 3 ore.
3. Iniezione stereotassica
- Allestimento dell'attrezzatura
- Assemblare e calibrare un telaio stereotassico per piccoli animali secondo le istruzioni del produttore per garantire l'accuratezza delle iniezioni intracraniche (ad esempio, dimensioni della siringa, volume desiderato e velocità di iniezione).
nota: Si raccomanda una velocità di infusione lenta (cioè 2 - 3 μL/min).
- Installare il materiale sotto una cabina di sicurezza microbica (MSC) per mantenere la sterilità degli strumenti e proteggere i topi dalle infezioni.
nota: Porre i "blocchi isotermi" a bagnomaria a 37 °C. Questo sistema limita l'ipotermia dei topi durante l'intervento chirurgico. I termofori, necessari per la cura post-procedurale, devono essere utilizzati durante il monitoraggio continuo della temperatura.
- Preparazione preoperatoria dell'animale
- Anestetizzare un topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) a 10 μL/g di peso corporeo del topo.
- Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per garantire l'anestesia e l'analgesia complete dell'animale.
nota: Qualsiasi movimento è indice di analgesia non profonda e, se ciò si verifica, sono necessari alcuni minuti in più prima di ripetere l'operazione.
- Una volta che il topo è adeguatamente anestetizzato, utilizzare le forbici per rimuovere il pelo dal sito chirurgico (tra le due orecchie, fino al naso).
- Preparazione preoperatoria delle cellule
- Risospendere accuratamente le cellule con una pipetta (più volte) prima di ogni iniezione per evitare la formazione di aggregazioni cellulari.
- Aspirare con cautela il volume di sospensione cellulare richiesto (15 - 20 μL) nella microsiringa da 22 G per evitare l'aspirazione di bolle.
nota: Questa fase di caricamento delle cellule nella microsiringa è importante per ridurre al minimo le variazioni nei volumi iniettati. Ricaricare le cellule per ogni singola iniezione tra le procedure per prevenire l'aggregazione delle cellule e garantire un numero uniforme di somministrazione di cellule effettrici nella coorte.
- Quindi, posizionare la siringa nella pompa a siringa adattata.
- Cura procedurale
- Disinfettare il sito chirurgico con tamponi imbevuti di soluzione di iodio povidone al 5% almeno 3 volte.
- Metti un unguento oftalmico lubrificante negli occhi del topo per prevenire l'essiccazione delle cornee.
- Posizionare il topo anestetizzato sul telaio stereotassico, su un blocco isotermico caldo coperto da un involucro di plastica sterile per mantenere la temperatura del topo durante l'intervento chirurgico e limitare la mortalità.
nota: Il naso e i denti del topo devono essere posizionati in modo appropriato sopra la barra del dente, per garantire un flusso respiratorio adeguato durante la procedura.
- Una volta posizionato il mouse sopra la barra dei denti, stringere saldamente le barre auricolari sotto le orecchie del mouse per immobilizzare la testa.
nota: Fare attenzione a non danneggiare i timpani o a compromettere la respirazione.
- Praticare un'incisione della cute sagittale della linea mediana di 1 - 2 cm con forbici sterili lungo la parte superiore del cranio dalla parte anteriore a quella posteriore per esporre il cranio.
- Identificare l'intersezione delle suture sagittale e coronale (Bregma) che fungano da punti di riferimento per la localizzazione stereotassica prima dell'iniezione (mostrata nella Figura 1).
- Posizionare la microsiringa sopra questo punto.
- Spostare la microsiringa di 2 mm a destra, lateralmente e 0,5 mm anteriormente al Bregma.
- Usando un microtrapano, fai un piccolo foro nel cranio con una punta da trapano sterile a coordinate predeterminate. Fai attenzione a rimanere superficiale per evitare qualsiasi lesione traumatica del cervello.
nota: In questo protocollo, le cellule immunitarie sono state iniettate all'interno di un tumore stabilito (una settimana dopo l'iniezione di cellule tumorali). La pelle deve essere riaperta (cicatrice) e l'iniezione deve essere eseguita alle stesse coordinate utilizzate per l'impianto della cellula tumorale (il foro è generalmente ancora presente fino a 2 settimane dopo l'iniezione). Sono state selezionate le coordinate per l'iniezione di cellule tumorali ed effettrici nel parenchima cerebrale.
- Iniezione di cellule effettrici immunitarie
- Inserire con cautela la microsiringa nel foro praticato e, muovendosi lentamente, far avanzare l'ago di 3 mm verso il basso nella dura madre e poi indietro di 0,5 mm fino a una profondità finale di 2,5 mm prima di iniettare le cellule effettrici.
- Eseguire l'iniezione della cellula effettrice a 2 - 3 μL/min e monitorare i topi per tutto il tempo di iniezione.
- Una volta completata l'iniezione, estrarre l'ago per solo 1 mm e mantenere la microsiringa in posizione per un ulteriore minuto prima di estrarre lentamente completamente la microsiringa, per evitare perdite dal sito di infusione.
nota: Dopo la rimozione dell'animale dal dispositivo stereotassico, pulire immediatamente l'attrezzatura di iniezione per i prossimi esperimenti.
- Cura post-operatoria e follow-up del topo
- Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e applicare immediatamente la soluzione di iodio povidone al 5% sul sito di incisione e chiudere la cute con un'appropriata sutura chirurgica.
- Applicare il gel di lidocaina al 2% direttamente sulla ferita e somministrare 0,15 μg/g di buprenorfina mediante iniezione sottocutanea per l'analgesia post-procedurale.
- Riposizionare il mouse anestetizzato nella sua gabbia sopra un termoforo impostato a 37 °C per mantenere una temperatura corporea del mouse adeguata ed evitare qualsiasi ipotermia.
nota: Non è necessario un alloggiamento separato.
- Monitorare il mouse fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia e trasferirlo in una stanza di alloggio.
nota: Ad oggi, questo protocollo è ben supportato in quanto si sono verificate poche complicanze impreviste (< 5% dei topi iniettati).
- Monitorare quotidianamente i topi e sopprimerli quando si osservano segni di salute in declino (ad esempio, postura curva, mobilità ridotta, prostrazione o significativa perdita di peso corporeo [≥ 15%]).
