Cellule CAR T geneticamente modificate utilizzando un sistema CRISPR-Cas9

Abstract

Fonte: Sterner, R. M. et al., Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle cellule CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)

Il video delinea un processo per la creazione di cellule CAR T geneticamente modificate attraverso il sistema CRISPR-Cas9. L'infezione delle cellule T con lentivirus CRISPR e CAR provoca modifiche al gene bersaglio e la sintesi di un recettore chimerico dell'antigene o CAR, portando infine alla formazione di cellule T CAR geneticamente modificate.

Protocol

1. Produzione di celle CART19

1. Isolamento, stimolazione e coltura ex-vivo delle cellule T
   1. Eseguire tutte le operazioni di coltura cellulare in una cappa per colture cellulari utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati. Raccogliere cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da coni di sangue di donatori normali anonimizzati raccolti durante l'aferesi, poiché questi sono noti per essere una valida fonte di PBMC.
   2. Per isolare le PBMC, aggiungere 15 mL di un mezzo a gradiente di densità a una provetta di separazione a gradiente di densità da 50 mL. Diluire il sangue del donatore con un volume uguale di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) per evitare l'intrappolamento delle cellule.
      1. Aggiungere il sangue diluito del donatore dal cono nella provetta di separazione, facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia tra il sangue e il mezzo del gradiente di densità. Centrifugare a 1.200 x g per 10 minuti a RT.
      2. Decantare il surnatante in un nuovo conico da 50 mL, lavare con PBS + 2% FBS portando fino a 40 mL, centrifugare a 300 x g per 8 min a RT, aspirare il surnatante, risospendere in 40 mL di tampone e contare le cellule.
   3. Isolare le cellule T dalle PBMC tramite un kit di biglie magnetiche a selezione negativa utilizzando un separatore di celle completamente automatizzato secondo il protocollo del produttore.
   4. Per coltivare le cellule T isolate, preparare un terreno di coltura di cellule T (MTC) costituito per il 10% da siero AB umano (v/v), per l'1% da penicillina-streptomicina-glutammina (v/v) e da terreno di cellule ematopoietiche privo di siero. Sterilizzare il terreno filtrando attraverso un filtro per vuoto sterile da 0,45 μm e quindi con un filtro per vuoto sterile da 0,22 μm.
   5. Il giorno 0 (il giorno della stimolazione delle cellule T), lavare le perle CD3/CD28 prima della stimolazione delle cellule T. Per il lavaggio, posizionare il volume richiesto di perle (utilizzare una quantità sufficiente di perle CD3/CD28 per un rapporto di 3:1 perline:cellule T; nota che la concentrazione delle microsfere può essere variabile) in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere in 1 mL di MTC.
   6. Mettere a contatto con un magnete.
   7. Dopo 1 minuto, aspirare il MTC e risospendere in 1 mL di MTC fresco per lavare le perle.
   8. Ripetere questa procedura per un totale di tre lavaggi.
   9. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le perle in 1 mL di MTC.
   10. Conta le cellule T.
   11. Trasferire le perle alle cellule T con un rapporto di 3:1 perline:cellule.
   12. Diluire le cellule fino a una concentrazione finale di 1 x 10⁶ cellule/mL.
   13. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 24 h.
2. Trasfezione e trasduzione delle cellule T
   1. Eseguire il lavoro lentivirale utilizzando le precauzioni BSL-2+, comprese le cappe per colture cellulari, i dispositivi di protezione individuale e la disinfezione dei materiali usati con candeggina prima dello smaltimento.
   2. Acquisire un costrutto del recettore chimerico dell'antigene-T19 (CART19) in un vettore lentivirale.
      nota: Il costrutto CART19 utilizzato qui è stato progettato e poi sintetizzato de novo utilizzando un fornitore di sintesi proteica disponibile in commercio. Il costrutto CAR è stato successivamente clonato in un lentivirus di terza generazione sotto il controllo di un promotore EF-1α. Il frammento di regione variabile a catena singola è derivato dal clone FMC63 e riconosce il CD19 umano. Il costrutto CAR19 possiede un dominio costimolatorio 4-1BB di seconda generazione e una stimolazione CD3ζ (FMC63-41BBz).
   3. Eseguire la produzione di lentivirali come descritto in precedenza.
      1. In breve, per produrre lentivirus, utilizzare 293 cellule T che hanno raggiunto il 70-90% di confluenza.
      2. Lasciare incubare per 30 minuti a temperatura ambiente i reagenti di trasfezione, inclusi 15 μg del plasmide lentivirale di interesse, 18 μg di un vettore di imballaggio gag/pol/tat/rev, 7 μg di un vettore di busta VSV-G, 111 μL del reagente di pre-complessazione, 129 μL del reagente di trasfezione e 9,0 mL del terreno di trasfezione prima di aggiungere alle 293 cellule T. Quindi coltivare le cellule trasfettate a 37 °C, 5% CO₂.
      3. Raccogliere, centrifugare (900 x g per 10 minuti), filtrare (filtro in nylon da 0,45 μM) e concentrare il surnatante a 24 e 48 ore mediante ultracentrifugazione a 13.028 x g per 18 ore o 112.700 x g per 2 ore.
      4. Congelare a -80 °C per un uso futuro.
   4. Il giorno 1, risospendere delicatamente le cellule T per rompere le rosette di cellule T che erano state stimolate a 1 x 10⁶/mL il giorno 0.
   5. Con le opportune precauzioni BSL-2+ per tutto il lavoro lentivirale, aggiungere il virus raccolto fresco o congelato alle cellule T stimolate a una molteplicità di infezione (MOI) di 3,0.
3. Espansione delle cellule T CAR
   1. Durante la fase di espansione, continuare a incubare le cellule T trasdotte a 37 °C, 5% CO₂. Contare le cellule T CAR nei giorni 3 e 5 e aggiungere alla coltura la MTC fresca e preriscaldata per mantenere una concentrazione di cellule T CAR di 1 x 10⁶/mL.
   2. Rimuovere le perle dalle cellule T trasdotte 6 giorni dopo la stimolazione (giorno 6) utilizzando un magnete. Raccogliere, risospendere e posizionare le cellule T in provette coniche da 50 mL in un magnete per 1 minuto. Quindi raccogliere il surnatante (contiene le cellule T CAR) e scartare le perline.
   3. Rimettere le cellule CAR T raccolte in coltura a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL per riprendere l'espansione.
   4. Il giorno 6, valutare l'espressione superficiale del CAR mediante citometria a flusso.
      nota: Diversi metodi possono essere utilizzati per rilevare l'espressione superficiale di CAR, come la colorazione con un anticorpo secondario anti-IgG di capra (H+L) crossadsorbito o la colorazione con un peptide specifico per CD19, coniugato a un fluorocromo. Qui, prelevare un'aliquota (circa 100.000 cellule T) dalla coltura e lavare con tampone di flusso preparato con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, siero bovino fetale al 2% e sodio azide all'1%. Colorare le cellule con l'anticorpo anti-CAR e lavare due volte. Colorare le cellule con colorante vivo/morto e anticorpo monoclonale CD3 (OKT3). Lavare le celle e risospendere nel buffer di flusso. Acquisire su un citometro per determinare l'efficienza di trasduzione.
4. Crioconservazione con cellule T CAR
   1. Per raccogliere e crioconservare le cellule T CAR 8 giorni dopo la stimolazione (giorno 8 di espansione delle cellule T), prelevare le cellule dalla coltura.
   2. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
   3. Risospendere in terreno di congelamento a 10 milioni di cellule per mL per flaconcino in terreno di congelamento costituito per il 10% da dimetilsolfossido e per il 90% da siero fetale bovino.
   4. Congelare in un contenitore di congelamento per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 °C/min in un congelatore a -80 °C e quindi trasferire in azoto liquido dopo 48 ore.
   5. Prima del loro utilizzo per esperimenti in vitro o in vivo, scongelare le cellule T CAR in MTC calda.
   6. Lavare le cellule per diluire e rimuovere il dimetilsolfossido e risospendere a una concentrazione di 2 x 10⁶ cellule/mL in MTC caldo. Riposare per una notte a 37 °C, 5% CO₂.

2. Produzione di CART19 del fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF ^k/o)

1. Per distruggere GM-CSF, utilizzare un RNA guida (gRNA) che ha come bersaglio l'esone 3 di GM-CSF umano (CSF2) selezionato tramite screening di gRNA precedentemente segnalati per avere un'elevata efficienza per il gene CSF2 che codifica per la citochina umana GM-CSF.
   nota: È stato utilizzato un costrutto lentivirale di terza generazione Cas9 di grado di ricerca sintetizzato commercialmente contenente questo gRNA (sotto un promotore U6). Il costrutto contiene un gene di resistenza alla puromicina. La sequenza del gRNA è GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. Per produrre lentivirus, utilizzare cellule 293T che hanno raggiunto il 70-90% di confluenza.
3. Lasciare incubare per 30 minuti a temperatura ambiente 15 μg del plasmide lentivirale di interesse, 18 μg di un vettore di imballaggio gag/pol/tat/rev, 7 μg di un vettore di busta VSV-G, 111 μl del reagente pre-complessante, 129 μl del reagente di trasfezione e 9,0 mL del mezzo di trasfezione.
4. Aggiungere i reagenti di trasfezione alle cellule 293T. La coltura a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO₂).
5. Raccogliere, centrifugare (900 x g per 10 min), filtrare (filtro in nylon da 0,45 μM) e concentrare il surnatante a 24 e 48 ore mediante ultracentrifugazione a 13.028 x g per 18 ore o 112.700 x g per 2 ore e congelare a -80 °C per un uso futuro.
6. Il giorno 1, risospendere delicatamente le cellule T per rompere le rosette.
7. In un laboratorio approvato BSL-2+, aggiungere un virus congelato o appena raccolto alle cellule T stimolate per generare cellule T CAR. Trasdurre le cellule T sia con il lentivirus CAR19 che con il lentivirus CRISPR GM-CSF. Aggiungere il lentivirus CAR19 a un MOI di 3. Poiché la titolazione del lentivirus CRISPR non era fattibile, utilizzare particelle virali generate da una preparazione plasmidica da 15 ug per trasdurre 10 x 10⁶ cellule T.
8. Vedere le restanti fasi della stimolazione, dell'espansione e della crioconservazione delle cellule T come discusso nella fase 1.
9. Per le cellule T modificate con lentiCRISPR che trasmettono resistenza alla puromicina, trattare le cellule con puromicina dicloridrato a una concentrazione di 1 μg di puromicina per 1 mL il giorno 3 e il giorno 5.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo monoclonale CD3 (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
Anticorpo monoclonale CD3 (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	Codice 17-0038-42
Scelta Taq Blu Mastermix	Denville Scientifico	C775Y51
CTS (Sistemi di Terapia Cellulare) Dynabeads CD3/CD28	Gibco	40203D
Sistema CytoFLEX B4-R2-V2	Beckman Coulter	Codice: C10343	Citometro a flusso
Dimetilsolfossido	Millipore Sigma	D2650-100ML
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Gibco	Codice 14190-144
Dynabeads MPC-S (Concentratore di Particelle Magnetiche)	Biosistemi Applicati	Codice: A13346
Magnete Easy 50 EasySep	Tecnologie STEMCELL	Anno 18002
Kit di isolamento delle cellule T umane EasySep	Tecnologie STEMCELL	Anno 17951	Perle magnetiche a selezione negativa; 17951RF include punte e tampone
Siero fetale bovino	Millipore Sigma	F8067
FITC Topo Anti-Umano CD107a	BD Pharmingen	Codice: 555800
Mezzo di fissazione (Medium A)	Invitrogen	GAS001S100
Costrutto di gRNA GenCRISPR: Nome: CSF2	GenScript	N/A	Ordine personalizzato
RNA guida CRISPR 1; Specie: Umano, Vettore:
pLentiCRISPR v2; Resistenza: Ampicillina; Numero di copia:
alto; Preparazione del plasmide: Consegna standard: 4 μg (Gratuito
di carica)
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra, Alexa Fluor 647	Invitrogen	Codice A-21235
https://tide.nki.nl.	Genetica desktop
Siero AB umano; Donatori di sesso maschile; tipo AB; Noi	Corning	35-060-CI
Anticorpo monoclonale IFN gamma (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD Kit di colorazione Aqua Dead Cell fissabile, per eccitazione a 405 nm	Invitrogen	L34966
Lymphoprep	Tecnologie STEMCELL	Codice: 7851
Monensin soluzione, 1000X	BioLeggenda	420701
Topo Anti-Umano CD28 Clone CD28.2	BD Pharmingen	Codice: 559770
Topo Anti-Umano CD49d Clone 9F10	BD Pharmingen	561892
Topo Anti-Umano MIP-1β PE-Cy7	BD Pharmingen	560687
Mr. Frosty Contenitore di congelamento	Termo Scientifico	Codice: 5100-0001
NALM6, clone G5	ATCC	Codice CRL-3273	Linea cellulare di leucemia linfoblastica acuta
Acqua priva di nucleasi	Promega	P119C
Sistemi di filtraggio sottovuoto Olympus, 500 mL, membrana in PES, 0.22uM, sterile	Genesee Scientifico	25-227
Sistemi di Filtraggio Sottovuoto Olympus, 500 mL, membrana in PES, 0.45uM, sterile	Genesee Scientifico	25-228
Opti-MEM I Siero Ridotto Medium (1X), Liquido	Gibco	Codice 31985-070
PE-CF594 Topo Anti-Umano IL-2	BD Orizzonte	562384
Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100X), Liquido	Gibco	Codice 10378-016
Mezzo di permeabilizzazione (Medium B)	Invitrogen	GAS002S100
Mini kit PureLink per DNA genomico	Invitrogen	K182001
Puromicina dicloridrato	MP Biomedicals, Inc.	210055210
Kit di estrazione del gel QIAquick	QIAGEN	Codice 28704
Ratto anti-umano GM-CSF BV421	BD Orizzonte	Codice: 562930
RoboSep-S	Tecnologie STEMCELL	21000	Separatore di celle completamente automatizzato
SepMate-50 (IVD)	Tecnologie STEMCELL	Codice 85450
Sodio azide, 5% (p/v)	Ricca Chimica	7144.8-16
X-VIVO 15 Terreno cellulare ematopoietico senza siero	Lonza	04-418Q