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Articolo metodologico
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8 luglio 2025
Fonte: Sterner, R. M. et al., Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle cellule CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)
Il video delinea un processo per la creazione di cellule CAR T geneticamente modificate attraverso il sistema CRISPR-Cas9. L'infezione delle cellule T con lentivirus CRISPR e CAR provoca modifiche al gene bersaglio e la sintesi di un recettore chimerico dell'antigene o CAR, portando infine alla formazione di cellule T CAR geneticamente modificate.
1. Produzione di celle CART19
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo monoclonale CD3 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| Anticorpo monoclonale CD3 (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | Codice 17-0038-42 | |
| Scelta Taq Blu Mastermix | Denville Scientifico | C775Y51 | |
| CTS (Sistemi di Terapia Cellulare) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| Sistema CytoFLEX B4-R2-V2 | Beckman Coulter | Codice: C10343 | Citometro a flusso |
| Dimetilsolfossido | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Gibco | Codice 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Concentratore di Particelle Magnetiche) | Biosistemi Applicati | Codice: A13346 | |
| Magnete Easy 50 EasySep | Tecnologie STEMCELL | Anno 18002 | |
| Kit di isolamento delle cellule T umane EasySep | Tecnologie STEMCELL | Anno 17951 | Perle magnetiche a selezione negativa; 17951RF include punte e tampone |
| Siero fetale bovino | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Topo Anti-Umano CD107a | BD Pharmingen | Codice: 555800 | |
| Mezzo di fissazione (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| Costrutto di gRNA GenCRISPR: Nome: CSF2 | GenScript | N/A | Ordine personalizzato |
| RNA guida CRISPR 1; Specie: Umano, Vettore: | |||
| pLentiCRISPR v2; Resistenza: Ampicillina; Numero di copia: | |||
| alto; Preparazione del plasmide: Consegna standard: 4 μg (Gratuito | |||
| di carica) | |||
| Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-topo di capra, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | Codice A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Genetica desktop | ||
| Siero AB umano; Donatori di sesso maschile; tipo AB; Noi | Corning | 35-060-CI | |
| Anticorpo monoclonale IFN gamma (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Kit di colorazione Aqua Dead Cell fissabile, per eccitazione a 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | Tecnologie STEMCELL | Codice: 7851 | |
| Monensin soluzione, 1000X | BioLeggenda | 420701 | |
| Topo Anti-Umano CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | Codice: 559770 | |
| Topo Anti-Umano CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Topo Anti-Umano MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Contenitore di congelamento | Termo Scientifico | Codice: 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | Codice CRL-3273 | Linea cellulare di leucemia linfoblastica acuta |
| Acqua priva di nucleasi | Promega | P119C | |
| Sistemi di filtraggio sottovuoto Olympus, 500 mL, membrana in PES, 0.22uM, sterile | Genesee Scientifico | 25-227 | |
| Sistemi di Filtraggio Sottovuoto Olympus, 500 mL, membrana in PES, 0.45uM, sterile | Genesee Scientifico | 25-228 | |
| Opti-MEM I Siero Ridotto Medium (1X), Liquido | Gibco | Codice 31985-070 | |
| PE-CF594 Topo Anti-Umano IL-2 | BD Orizzonte | 562384 | |
| Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100X), Liquido | Gibco | Codice 10378-016 | |
| Mezzo di permeabilizzazione (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| Mini kit PureLink per DNA genomico | Invitrogen | K182001 | |
| Puromicina dicloridrato | MP Biomedicals, Inc. | 210055210 | |
| Kit di estrazione del gel QIAquick | QIAGEN | Codice 28704 | |
| Ratto anti-umano GM-CSF BV421 | BD Orizzonte | Codice: 562930 | |
| RoboSep-S | Tecnologie STEMCELL | 21000 | Separatore di celle completamente automatizzato |
| SepMate-50 (IVD) | Tecnologie STEMCELL | Codice 85450 | |
| Sodio azide, 5% (p/v) | Ricca Chimica | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Terreno cellulare ematopoietico senza siero | Lonza | 04-418Q |
