Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

In questo articolo

Abstract

Fonte: Agarwal, S., et al. Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate con CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra un test per l'esecuzione dell'editing genetico in cellule T umane utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Una miscela di cellule T primarie CD4+ e CD8+ è combinata con un complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, mirato a geni specifici per il knockout. Dopo l'elettroporazione, l'sgRNA guida Cas9 verso la sequenza di DNA bersaglio, creando tagli precisi. Questi tagli vengono poi riparati dal meccanismo di giunzione non omologa della cellula, portando al knockout genico.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Progettazione di sgRNA e distruzione genica in cellule T umane primarie

Progettazione di sgRNA CRISPR
nota: Diversi server e programmi facilitano la progettazione di RNA guida singola (sgRNA) specifici per il bersaglio. In questo protocollo, gli sgRNA CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sono stati progettati utilizzando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) e il portale di progettazione del gRNA del Broad Institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
1. Per ogni gene bersaglio, progettare da sei a dieci sequenze di sgRNA per indirizzare le sequenze di esoni codificanti precocemente.
  NOTA: l'sgRNA dovrebbe avere un'elevata efficacia on-target e una bassa efficacia off-target. Ogni algoritmo di apprendimento automatico per determinare l'efficacia dell'sgRNA funziona in modo leggermente diverso. Pertanto, si consiglia di confrontare più strumenti di progettazione di sgRNA e di curare un elenco da sei a dieci sgRNA per lo screening.
Distruzione genica nelle cellule T umane primarie
1. Ottenere cellule mononucleate autologhe del sangue periferico (PBMC) da donatori volontari sani. Una cronologia schematica del protocollo è descritta nella Figura 1A e descritta di seguito.
2. Isolare le cellule T CD4+ e CD8+ utilizzando i kit di selezione CD4 e CD8 disponibili in commercio.
3. Combinare le cellule T CD4+ e CD8+ in un rapporto 1:1 e incubare per una notte a 3x10⁶ cellule/mL in R10 integrate con 5 ng/mL di interleuchina-7 umana (huIL-7) e interleuchina umana-15 (huIL-15) ciascuna. L'aggiunta di IL-7 e IL-15 è raccomandata in quanto sono noti per promuovere un fenotipo di memoria centrale e le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T espanse con IL-7 e IL-15 hanno un'efficacia antitumorale superiore rispetto alle cellule CAR-T espanse dell'interleuchina-2 (IL-2).
4. Il giorno successivo, contare le cellule T e centrifugare 5-10 x 10⁶ cellule a 300 x g per 5 minuti. Scartare tutto il surnatante e lavare il pellet cellulare in un terreno minimo essenziale a siero ridotto. Risospendere il pellet in 100 μL di soluzione di nucleofezione secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
5. Durante il lavaggio delle cellule, preparare il complesso ribonucleoproteico (RNP) con la proteina 9 associata a CRISPR (Cas9) e il gRNA incubando 10 μg di nucleasi Cas9 con 5 μg di sgRNA per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Il rapporto molare tra Cas9 e sgRNA è 1:2,4. Si raccomanda un controllo simulato che contenga Cas9 e un potenziatore dell'elettroporazione, ma non sgRNA.
  nota: L'editing genico multiplex può essere eseguito in questa fase creando complessi RNP per ciascun bersaglio separatamente e combinandoli con le cellule al momento della nucleofezione, come descritto nella fase successiva. La scelta dei reagenti per assemblare il complesso RNP è la chiave per ottenere un'elevata efficienza di knockout (KO). Ad esempio, le nucleasi Cas9 di diversi fornitori hanno effetti diversi fuori bersaglio e il gRNA chimicamente modificato riduce la tossicità per le cellule T, aumentando così l'efficienza del KO.
6. Combinare le cellule risospese del passaggio 1.2.4 con il complesso RNP del passaggio 1.2.5 e aggiungere 4,2 μL di potenziatore dell'elettroporazione da 4 μM (oligonucleotide di DNA a filamento singolo [ssDNA] non omologo al genoma umano). Mescolare bene e trasferire in cuvette per elettroporazione. Evitare le bolle in quanto compromettono l'efficienza dell'elettroporazione.
7. Celle elettroporate con codice a impulsi EH111. Dopo l'elettroporazione, incubare le cellule in R10 integrate con 5 ng/mL di huIL-7 e huIL-15 a 5x10⁶ cellule/mL a 30 °C per 48 ore in piastre a 12 pozzetti. Dopo 48 ore, procedere con l'attivazione e l'espansione delle cellule T.

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Risultati

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Figura 1. Espansione delle cellule CAR-T modificate e loro raddoppi di popolazione. (A) Cronologia dell'editing e della produzione di CRISPR in cellule CART umane primarie. (B) Raddoppi della popolazione in cellule CAR-T CD19 Mock e CRISPR-edited misurate utilizzando un contatore di Coltro durante l'espansione delle cellule CAR-T (n=3 donatori sani; ...