Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

In questo articolo

Abstract

Fonte: Agarwal, S., et al. Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate con CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra un test per l'esecuzione dell'editing genetico in cellule T umane utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Una miscela di cellule T primarie CD4+ e CD8+ è combinata con un complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, mirato a geni specifici per il knockout. Dopo l'elettroporazione, l'sgRNA guida Cas9 verso la sequenza di DNA bersaglio, creando tagli precisi. Questi tagli vengono poi riparati dal meccanismo di giunzione non omologa della cellula, portando al knockout genico.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Progettazione di sgRNA e distruzione genica in cellule T umane primarie

Progettazione di sgRNA CRISPR
nota: Diversi server e programmi facilitano la progettazione di RNA guida singola (sgRNA) specifici per il bersaglio. In questo protocollo, gli sgRNA CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sono stati progettati utilizzando CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) e il portale di progettazione del gRNA del Broad Institute (https://po....

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Risultati

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Figura 1. Espansione delle cellule CAR-T modificate e loro raddoppi di popolazione. (A) Cronologia dell'editing e della produzione di CRISPR in cellule CART umane primarie. (B) Raddoppi della popolazione in cellule CAR-T CD19 Mock e CRISPR-edited misurate utilizzando un contatore di Coltro durante l'espansione delle cellule CAR-T (n=3 donatori sani; .......