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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Alloggio e manutenzione dei topi
- Acquista topi NSG di 6-8 settimane (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Alloggiare i topi in condizioni SPF con ricambio d'aria, prefiltri e filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air) (0,22 μm) in una stanza con temperatura, umidità e pressione controllate.
- Alloggiare e mantenere i topi in gabbie di microisolatori individuali autoclavati in un sistema rack in grado di gestire il ricambio d'aria con prefiltri e filtri HEPA (0,22 μm).
- Eseguire tutte le procedure e le manipolazioni dei topi in una cappa di sicurezza biologica di Classe II di tipo A2 che è stata pretrattata con etanolo al 70%. Prima di lavorare nella stanza degli animali, fai la doccia e cambiati con camici puliti, tuta in Tyvek, copristivali, berretto per capelli, maschera per il viso e guanti. Indossare un camice chirurgico sopra la tuta in Tyvek durante le procedure chirurgiche.
nota: Anche la decontaminazione con luce ultravioletta (UV) è preferita prima delle procedure.
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti e i reagenti, se possibile, e poi disinfettarli prima di trasferirli nella cappa aspirante.
- Durante le procedure, rimuovere le gabbie ventilate individualmente degli animali dalla rastrelliera e disinfettarle prima di trasferirle nella cappa aspirante.
- Nutri i topi con una dieta irradiata e fornisci acqua autoclavata. Fornire cibo irradiato e integrare con altro cibo irradiato secondo necessità. Cambiare l'acqua sterilizzata in autoclave settimanalmente o secondo necessità.
nota: Può essere utilizzata anche acqua acidificata autoclavata. La dieta irradiata fornita aveva una durata di conservazione di 6 mesi dopo la produzione.
2. Generazione di topi umanizzati di midollo osseo, fegato e timo (BLT)
NOTA: La generazione di topi hu-BLT è stata descritta in precedenza.
- Il giorno dell'intervento, somministrare ai topi irradiazione di tutto il corpo alla dose di 12 cGy/g di peso corporeo.
- Prepara i topi per l'intervento chirurgico.
- Somministrare a ciascun topo irradiato una miscela di ketamina alla concentrazione di lavoro di 100 mg/kg e xilazina alla concentrazione di 12 mg/kg, che variava da 130 a 170 μl per topo in base al peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale (IP) per anestesia. Per preparare 3 ml della miscela di ketamina e xilazina, aggiungere 0,27 ml di ketamina alla concentrazione madre di 100 mg/mL e 0,03 ml di xilazina alla concentrazione di 100 mg/mL a 2,7 ml di soluzione fisiologica sterile e mescolare bene. Disinfettare la pelle con isopropanolo al 70% prima dell'iniezione.
- Somministrare a ciascun topo irradiato Buprenorfina 1 mg/kg di peso corporeo (semi-vita 72 ore, SR-LAB) mediante iniezione sottocutanea per una gestione del dolore di lunga durata.
- Somministrare a ciascun topo irradiato 100 μL (858 μg) di Cefazolina mediante iniezione IP per la profilassi antibiotica preoperatoria.
- Radere i peli dei topi utilizzando un tagliacapelli elettrico attorno al lato laterale sinistro e mediale del topo nel sito chirurgico successivo utilizzato per esporre il rene sinistro.
- Verificare il corretto livello di anestesia mediante il riflesso del pedale (pizzicamento deciso delle dita).
- Somministrare gas isoflurano al 3-5% se è necessaria un'ulteriore anestesia in qualsiasi momento durante l'intervento chirurgico.
- Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale. Applicare il marchio auricolare se necessario.
- Eseguire un intervento chirurgico per impiantare i tessuti del fegato e del timo nella capsula renale sinistra.
- Disinfettare la pelle nel sito chirurgico applicando lo scrub allo iodio partendo dal centro del sito chirurgico e spostandosi verso l'esterno in modo circolare. Ripetere questo processo con isopropanolo al 70% e una terza volta con iodio.
- Usando una pinza, caricare prima un frammento di tessuto epatico fetale umano in un trocar. Quindi, usando una pinza, caricare un frammento di tessuto di timo fetale umano nel trocar. Quindi, usando una pinza, caricare un altro frammento di tessuto epatico fetale umano nel trocar. I fazzoletti devono essere tagliati a 1-1,6 mm3 per adattarsi alle dimensioni interne del trocar.
- Usa le pinze per sollevare la pelle e usa le forbici per fare un piccolo taglio longitudinalmente. Estendi il taglio a 1,5-2 cm nella parte sinistra del mouse.
- Usa le pinze per sollevare lo strato muscolare e usa le forbici per fare un piccolo taglio longitudinalmente. Estendere il taglio secondo necessità per esporre il rene.
- Esporre il rene afferrando delicatamente il tessuto adiposo che circonda il rene. Non toccare direttamente il parenchima renale.
- Praticare un'incisione di 1-2 mm all'estremità posteriore della capsula renale utilizzando un bisturi.
- Inserire lentamente il trocar precaricato attraverso l'incisione parallela all'asse lungo del rene e rilasciare i tessuti tra la capsula renale e il rene.
- Riporti con cura il rene e l'intestino nella loro posizione normale. Utilizzare suture assorbibili 5/0 P-3 (P-13) con ago circolare da 13 mm e 3/8 per chiudere lo strato muscolare e graffette chirurgiche per chiudere la pelle.
- Dopo l'intervento chirurgico, mettere il topo in una gabbia di microisolatore autoclavata pulita per il recupero.
- Per ridurre al minimo la perdita di calore durante il recupero post-operatorio, metti la gabbia contenente i topi su un termoforo collegato a una pompa dell'acqua che riscalda e fa circolare l'acqua.
- Monitorare i topi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
- Entro 6 ore dal completamento dell'intervento, attraverso la vena di coda, iniettare cellule staminali ematopoietiche CD34+ isolate dal tessuto epatico fetale umano.
- Riscalda i topi con una lampada termica. Disinfettare la coda con isopropanolo al 70% e quindi iniettare da 1,5 a 5 × 105 cellule staminali/200 μl nella vena caudale.
- Arrestare qualsiasi sanguinamento dall'iniezione e riportare i topi nella gabbia del microisolatore e la gabbia del microisolatore nel rack della gabbia.
nota: I topi post-chirurgici sono in genere alloggiati insieme, cinque per gabbia del microisolatore, durante e dopo il recupero. Tuttavia, i topi sono alloggiati insieme solo se tutti hanno ricevuto un intervento chirurgico lo stesso giorno.
- Controlla i topi ogni giorno. Monitorare attentamente le graffette chirurgiche e sostituirle secondo necessità. Monitora attentamente i topi per qualsiasi segno di infezione o disagio. Fornire cibo autoclavato sul pavimento della gabbia del microisolatore per alcuni giorni dopo l'intervento.
- Rimuovere le graffette chirurgiche 7-10 giorni dopo l'intervento. Somministrare gas isoflurano al 3-5% per anestetizzare i topi. Rimuovere con cura le graffette e quindi applicare un unguento antibiotico e antidolorifico sul sito.
- Attendere 9-12 settimane per la ricostituzione delle cellule immunitarie umane, quindi raccogliere il sangue periferico dalla vena safena mediale da ciascuno dei topi umanizzati.
- Trattenere i topi coscienti utilizzando un cono di plastica di dimensioni adeguate con un'apertura vicino alla testa del topo per la respirazione e un'apertura vicino alla parte posteriore del topo per isolare una gamba. Metti prima i topi nella testa del cono di contenzione e poi tira delicatamente una gamba attraverso l'apertura della gamba.
- Spruzzare il lato mediale della gamba isolata con isopropanolo al 70%, quindi distribuire antibiotico e unguento antidolorifico sullo stesso sito.
nota: L'unguento aiuta a rivelare la posizione della vena senza la necessità di depilazione e aiuta anche nella formazione di goccioline di sangue.
- Utilizzando un ago calibro 25 con un angolo di 90°, perforare la vena e raccogliere 50-100 μL di sangue utilizzando una provetta per la raccolta del sangue rivestita di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Fermare l'emorragia applicando pressione sul sito con una garza sterile. Una volta che l'emorragia si è fermata, rimetti i topi nella loro gabbia.
nota: I volumi massimi di sangue raccolti sono in genere 50 μl a settimana o 100 μl ogni due settimane.
- Utilizzare il sangue periferico raccolto per testare il livello di ricostituzione delle cellule immunitarie umane utilizzando la citometria a flusso con anticorpi per hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. Trattamento antibiotico
- Prima del trattamento antibiotico, raccogliere campioni fecali pre-trattamento. Spostare i topi in una nuova gabbia per microisolatori autoclavati.
- Prepara ogni giorno un cocktail fresco di antibiotici ad ampio spettro.
- Preparare 250 ml di acqua contenente metronidazolo (1 g/L), neomicina (1 g/L), vancomicina (0,5 g/L) e ampicillina (1 g/L) preparati al momento per ogni gabbia di microisolatori di topi.
nota: Utilizzare acqua autoclavata o sterile per l'acqua potabile integrata con antibiotici.
- Aggiungere 9,2 g di bevanda zuccherata con zucchero d'uva a 250 ml di acqua integrata con antibiotici.
nota: L'uso di un mix di bevande zuccherate con zucchero d'uva maschera il sapore amaro degli antibiotici e aiuta a prevenire la disidratazione nei topi.
- Cambia l'antibiotico e la bevanda zuccherata con zucchero d'uva, mescola l'acqua integrata e metti i topi in una nuova gabbia autoclavata ogni giorno.
nota: I topi sono coprofagici e cambiare le gabbie ogni giorno impedisce ai topi di reinocularsi con i batteri intestinali.
- Per il massimo attecchimento del microbioma intestinale simile a quello umano, fornire antibiotici per 14 giorni. Durante il trattamento antibiotico, monitorare i topi per la perdita di peso e la disidratazione. La perdita di peso è prevista durante i primi 3-4 giorni e successivamente si stabilizza per tutta la durata del trattamento. Se si verifica disidratazione, somministrare ai topi soluzione salina o Ringers tramite iniezione intraperitoneale.
nota: Altri protocolli di umanizzazione del microbioma intestinale richiedono l'uso orale di antibiotici. Sebbene sia efficace nell'esaurire i batteri intestinali murina, abbiamo scoperto che il metodo meno invasivo di aggiungere antibiotici all'acqua potabile ha messo meno stress sui nostri topi umanizzati e ha portato a risultati migliori.
4. Campioni di donatori e trapianto fecale
- Preparare campioni fecali di donatori umani.
- Utilizzare fonti adeguatamente preparate di materiale per il trapianto di microbiota fecale (FMT) per il trapianto fecale nei topi umanizzati.
- Scongelare i preparati FMT e aliquotarli in condizioni anaerobiche in una camera anaerobica.
- Se lo si desidera, in questa fase mescolare parti uguali dei campioni fecali per creare un campione "umano" imparziale.
- Mantenere il congelamento e lo scongelamento del materiale FMT al minimo, se non è necessaria l'aliquotazione o la miscelazione dei campioni, scongelare solo immediatamente prima della procedura.
- Trapianto fecale umano
- Dopo il completamento di 14 giorni di trattamento antibiotico, cambiare l'acqua potabile con acqua autoclavata e spostare i topi in una nuova gabbia autoclavata. Smetti di cambiare la gabbia ogni giorno e implementa un programma di cambio gabbia una volta ogni 1-2 settimane.
- Fai due trapianti fecali a 24 e 48 ore dopo l'interruzione degli antibiotici.
- 24 ore dopo il trattamento antibiotico, scongelare la quantità necessaria di materiale FMT e somministrare a ciascun topo 200 μL di materiale FMT tramite sonda orale. Ripetere nuovamente la procedura a 48 ore dopo l'assunzione di antibiotici.
- Stendere il materiale FMT scongelato rimanente o residuo sulla pelliccia dei topi umanizzati o sulla lettiera della gabbia.