Generazione di un vaccino multivalente con vescicole della membrana esterna

Abstract

Fonte: Feng, R., et al. Una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "plug-and-display" basata su vescicole di membrana esterna che mostrano il dominio di legame del recettore SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra un metodo per generare vaccini multivalenti con vescicole di membrana esterna (OMV). Le cellule di mammifero vengono trasfettate per esprimere e secernere antigeni virali fusi a uno SpyTag e a un tag di poliistidina. Questi antigeni vengono quindi purificati utilizzando una colonna di affinità per acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA). L'antigene purificato viene miscelato con vescicole della membrana esterna che esprimono la proteina SpyCatcher (SC) legata alla superficie. Più antigeni si legano covalentemente agli SpyCatcher tramite i loro SpyTag (ST), creando OMV che mostrano l'antigene, fungendo da vaccino multivalente.

Protocol

1. Costruzione di plasmidi

1. Inserire la sequenza di DNA che codifica SpyCatcher (Figura 1) in un plasmide pThioHisA-Citolisina A (ClyA) resistente all'ampicillina (vedi Tabella dei materiali) tra i siti BamH I e Sal I per costruire il plasmide pThioHisA ClyA-SC a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato.
2. Collegare il gene di fusione sintetizzato SpyTag-SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD)-polyhistidine tag (Histag) (Figura 1) in un plasmide pcDNA3.1 (vedi Tabella dei materiali) tra i siti BamH I ed EcoR I per costruire il plasmide pcDNA3.1 RBD-ST a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato.

2. Preparazione OMV-SC

1. Eseguire la trasformazione ClyA-SC seguendo i passaggi seguenti.
   1. Aggiungere 5 μL di soluzione plasmidico pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL di ceppo BL21 competente, soffiare delicatamente e lasciare raffreddare con ghiaccio per 30 minuti.
   2. Mettere la soluzione per 90 s a bagnomaria a 42 °C, quindi mettere immediatamente la soluzione miscelata sul ghiaccio per 3 minuti.
   3. Aggiungere 500 μl di terreno Luria-Bertani (LB) alla sospensione batterica e, dopo la miscelazione, coltura a 220 giri/min a 37 °C per 1 ora.
   4. Disporre tutta la trasformazione su una piastra di agar LB contenente ampicillina (100 μg/mL, vedere la Tabella dei materiali) e coltivare per una notte a 37 °C.
      nota: Negli esperimenti successivi, l'ampicillina è stata mantenuta alla stessa concentrazione nel mezzo. In caso contrario, ciò può causare la perdita di plasmidi nei batteri.
2. Per la produzione OMV-SC, eseguire i passaggi seguenti.
   1. Isolare una singola colonia dalla piastra (passaggio 2.1.4.) in 20 mL di terreno LB (resistente all'ampicillina) e coltivare per una notte a 220 giri/min a 37 °C.
   2. Inoculare la soluzione batterica (dal punto 2.2.1) in terreno da 2 L, coltura a 220 giri/min, 37 °C per 5 ore fino alla fase di crescita logaritmica (il diametro esterno_{di 600}nm è compreso tra 0,6 e 0,8).
   3. Quando l'OD a 600 nm della soluzione batterica raggiunge 0,6-0,8, aggiungere isopropil beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG, vedere la Tabella dei materiali) per ottenere la concentrazione finale della soluzione batterica a 0,5 mM, quindi coltivare per una notte a 220 giri/min a 25 °C.
3. Eseguire la purificazione OMV-SC.
   1. Centrifugare la soluzione batterica a 7.000 x g a 4 °C per 30 minuti.
   2. Filtrare il surnatante con un filtro a membrana da 0,22 μm, quindi concentrarlo utilizzando una membrana di ultrafiltrazione da 100 kD o una colonna a fibra cava (vedi Tabella dei materiali).
   3. Filtrare il concentrato attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm, quindi centrifugarlo a 150.000 x g a 4 °C per 2 ore utilizzando un'ultracentrifuga (vedere la Tabella dei materiali) e scartare il surnatante con una pipetta.
   4. Risospendere la precipitazione con PBS e conservarla a −80 °C. La soluzione può mantenere la stabilità a lungo termine a -80 °C.

3. Preparazione RBD-ST

1. Eseguire la trasfezione RBD-ST seguendo i passaggi seguenti.
   1. Selezionare un sistema di espressione eucariotico appropriato (ad es. HEK293F) e coltivare le cellule durante la notte a 130 giri/min a 37 °C dopo il recupero.
   2. Aggiungere 20 μl di soluzione cellulare HEK293F nel contatore automatico di cellule (vedere la tabella dei materiali), registrare il numero di cellule, regolare la concentrazione a 1 x 106 cellule/mL e quindi coltivare le cellule a 130 giri/min a 37 °C per 4 ore.
   3. Filtrare il plasmide RBD-ST attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm e aggiungere 300 μg di plasmidi nel terreno di coltura cellulare (vedi Tabella dei materiali) fino a quando il volume finale è di 10 mL; agitare per 10 s.
   4. Riscaldare la polietilenimmina (PEI, 1 mg/mL, vedere la Tabella dei materiali) a 65 °C nel bagnomaria, miscelare 0,7 mL di PEI con 9,3 mL di terreno di coltura cellulare e agitare a intermittenza per 10 s.
      nota: Non agitare energicamente la soluzione. In caso contrario, le bolle risultanti possono influire sull'efficienza della trasfezione.
   5. Aggiungere la soluzione plasmidica alla soluzione di PEI, agitare la miscela a intermittenza per 10 s e incubarla a 37 °C per 15 minuti.
   6. Aggiungere la miscela a 280 mL di terreno di coltura cellulare e coltivare a 130 giri/min a 37 °C per 5 giorni.
2. Eseguire la purificazione RBD-ST.
   1. Centrifugare le cellule a 6.000 x g a 25 °C per 20 minuti e utilizzare una pipetta per raccogliere il surnatante.
   2. Riempire la colonna con 2 mL di agarosio Ni-NTA (vedi Tabella dei materiali) e lavarla 3 volte con 3 PBS.
   3. Aggiungere l'imidazolo (vedere la Tabella dei materiali) nel surnatante cellulare per ottenere la concentrazione finale di 20 mM e caricare il surnatante cellulare 2 volte.
   4. Aggiungere 3 volumi di colonna (CV) di PBS contenenti 20 mM di imidazolo per il lavaggio e raccogliere la frazione di lavaggio.
   5. Eluire in gradiente con 3 CV di PBS contenente concentrazioni da basse ad alte (ad es. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) di imidazolo; eluire 2 volte per ogni concentrazione.
   6. Utilizzare SDS-PAGE per identificare l'RBD-ST in diversi gradienti di concentrazione.

4. Bioconiugazione e purificazione OMV-RBD

1. Determinare la concentrazione proteica con il metodo del saggio dell'acido bicinchoninico (BCA) (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Diluire in serie la soluzione proteica standard di albumina sierica bovina (BSA) da 2 mg/mL a 0,0625 mg/mL, diluire 10x OMV-SC e RBD-ST purificati, quindi miscelare le soluzioni di lavoro BCA A e B (fornite nel kit di analisi) a un rapporto di 50:1 (v/v).
   2. Aggiungere la soluzione proteica diluita (25 μL/pozzetto) e miscelare con la soluzione di lavoro BCA (200 μL/pozzetto); incubare a 37 °C per 30 minuti.
   3. Misurare l'assorbanza (OD) a 562 nm di ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard.
2. Eseguire la bioconiugazione di OMV-SC e RBD-ST seguendo i passaggi seguenti.
   1. Miscelare OMV-SC e RBD-ST in PBS con un rapporto di 40:1 (p/p).
   2. Ruotare verticalmente per frullare la miscela per una notte a 15 giri/min a 4 °C.
      nota: Antigeni diversi possono reagire in proporzioni diverse. Si potrebbero provare diversi rapporti di reazione in base alle caratteristiche dell'antigene.

Results

Figura 1: Sequenze plasmidiche utilizzate nel presente studio.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillina sodica	Sangon Biotech	A610028
Contatore di celle automatizzato	Stella del conte	biotech
Kit di quantificazione delle proteine BCA	CWBIO	CW0014S
Apparecchio per elettroforesi	Cavoy	Potenza BV
Centrifuga di congelamento ad alta velocità	Bioridge	H2500R
His-Tag mouse mAb	Tecnologia di segnalazione cellulare	2366 secondi
Imidazolo	Sangon Biotech	A600277
Isopropil beta-D-tiogalattopiranoside	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA Superflusso di legame	Qiagen	Codice 70691
Terreno di coltura cellulare OPM-293	Opm bioscienze	81075-001
Plasmide RBD-ST pcDNA3.1	Wuhan genecreat tecnica biologica
Soluzione salina tampone fosfato	ZSGB-bio	ZLI-9061
Polietilenimmina Lineare	Poliscienze	Codice 23966-1
Scala delle proteine prestained	termo	Codice 26616
Plasmide pThioHisA ClyA-SC	Wuhan genecreat tecnica biologica
Sistemi da banco Quixstand (colonna in fibra cava da 100 kD)	GE sanità
Buffer di caricamento SDS-PAGE (5x)	Beyotime	P0015
cloruro di sodio	Sangon Biotech	A100241
Strumento di sospensione	Tecnologia di vita	Miscelatore Hula
Triptone	Ossoide	LP0042B
Ultracentrifuga	Coltro di Beckman	XPN-100
Spettrofotometro ultravioletto	Hitachi	U-3900
Estratto di lievito	Sangon Biotech	A610961