Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Formulazione e selezione del dispositivo per la generazione di aerosol farmaceutici
NOTA: La formulazione e la selezione del dispositivo dipendono dalle proprietà fisico-chimiche del singolo farmaco da aerosolizzare.
- Aerosol liquidi nebulizzati.
- Sciogliere il farmaco in 100 ml di acqua o soluzione fisiologica.
- Caricare una siringa da 100 ml con la soluzione farmacologica e posizionare la siringa nella pompa a siringa con una portata impostata a 1 ml/min.
- Collegare la pompa a siringa al nebulizzatore a getto e spurgare l'aria dalla linea di alimentazione che porta al nebulizzatore.
- Collegare la fonte d'aria pressurizzata al nebulizzatore a getto e impostare il flussometro su 10 L/min.
- Inserire il nebulizzatore a getto nel pre-separatore. Il pre-separatore collega il nebulizzatore al plenum centrale dell'aerosol dell'unità di inalazione (Figura 1).
NOTA: Molti composti farmaceutici hanno una solubilità acquosa limitata e sono meglio formulati come aerosol in polvere secca. Se è possibile realizzare una sospensione stabile da un composto di diametro aerodinamico mediano di massa micronizzata (MMAD < 5 μM), può essere utilizzata con il nebulizzatore a getto. Prestare attenzione in quanto la sospensione potrebbe ostruire il nebulizzatore. Sono state utilizzate concentrazioni di mangime del nebulizzatore da 1 mg/mL per composti potenti (come il broncodilatatore ipratropio) a 40 mg/mL di sospensioni (per composti meno potenti come il salbutamolo solfato). La velocità di alimentazione della pompa a siringa è impostata a 1 mL/min per un motivo pratico: consentire di completare il periodo di equilibrazione della concentrazione di aerosol e l'esposizione di 45 minuti senza la necessità di ricaricare la siringa.
2. Configurazione dell'esperimento di esposizione all'aerosol
- Misurare la concentrazione del farmaco (raccogliendo l'aerosol su un filtro assoluto) e la distribuzione granulometrica (raccogliendo l'aerosol utilizzando un impattatore a cascata) dell'aerosol che entra nell'unità di inalazione dopo il pre-separatore/ciclone. Utilizzare questi parametri, la ventilazione minuto dell'animale, il peso corporeo e il tempo di esposizione, per stimare la dose di farmaco depositata nei polmoni.
- Pesare il filtro assoluto e registrare il peso del filtro. Posizionare il filtro nel portafiltro e montare il portafiltro. Collegare l'ingresso del portafiltro assoluto a una porta di campionamento del plenum centrale per aerosol e l'uscita a una sorgente di vuoto impostata per campionare l'aerosol a una portata di 1 L/min per l'esperimento.
NOTA: La massa del farmaco sul filtro dopo il campionamento per 45 minuti può essere nell'intervallo inferiore al microgrammo e/o essere miscelata con lattosio, sale NaCl o un altro veicolo. È necessaria una microbilancia che legge fino a 0,1 microgrammi. Il filtro deve essere bilanciato e pesato in un ambiente a umidità controllata per ottenere un peso preciso del farmaco depositato sul filtro. Il peso del farmaco sui filtri può essere utilizzato solo nel calcolo della dose se non c'è un veicolo nella formulazione o se il veicolo è l'acqua. Quando nella formulazione è presente un veicolo diverso dall'acqua, il peso della sostanza sul filtro fornisce solo un punto di partenza stimato per un'ulteriore analisi del contenuto di farmaco mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
- Pesare e registrare il peso dei 7 filtri dello stadio di impatto in cascata e di un filtro finale "tailpiece". Posizionare un filtro su ciascuno dei sette stadi dell'impattatore a cascata e assemblare l'impattatore a cascata Mercer. Collegare l'ingresso dell'impattatore a cascata a una porta di campionamento del plenum centrale per aerosol e l'uscita a una sorgente di vuoto impostata per campionare l'aerosol alla velocità di flusso a cui è calibrato l'impattatore a cascata (di solito 0,5 o 1 L/min) per la durata dell'esperimento.
- Monitorare il contenuto di aerosol dell'unità di inalazione con il monitor di aerosol in tempo reale (vedere la tabella dei materiali e dei reagenti) per confermare che i generatori di aerosol siano funzionanti e producano un aerosol stabile durante l'esperimento. Collegare l'ingresso del monitor per aerosol in tempo reale a una porta centrale per il campionamento del plenum dell'aerosol e l'uscita a una fonte di vuoto impostata per campionare l'aerosol a una velocità di flusso di 1 L/min per l'esperimento.
NOTA: Il segnale di monitoraggio dell'aerosol in tempo reale è riportato in μg/L ma è calibrato per la polvere stradale e deve essere ricalibrato per ogni aerosol del farmaco per ottenere valori corretti di concentrazione di aerosol. La calibrazione non è necessaria quando si utilizza il monitor per confermare la presenza o l'assenza della concentrazione di aerosol e la stabilità temporale.
- Impostare i parametri di controllo del processo (flusso d'aria, vuoto, pressione, potenza del generatore di aerosol) sui valori richiesti che dipendono dal numero di animali collegati all'unità di inalazione. L'unità di inalazione e i generatori di aerosol sono continuamente controllati/monitorati da un sistema computerizzato di controllo/acquisizione dati di processo (DACO) fornito dal produttore (vedi Tabella dei materiali e dei reagenti). La portata d'aria nell'unità di inalazione deve essere almeno 2 volte la velocità di ventilazione totale al minuto di tutti gli animali nell'unità di inalazione per evitare un accumulo di CO2.
- Caricare i topi in sistemi di ritenuta solo per il naso prima di esporli all'aerosol nell'unità di inalazione solo per il naso. Caricare anche gli animali di controllo dello stress di ritenuta in sistemi di ritenuta per respirare l'aria della stanza.
NOTA: Un esperimento dose/risposta consiste in più gruppi di topi esposti all'aerosol per diversi periodi di tempo. Il tempo di esposizione controlla la dose di ciascun gruppo durante un esperimento dose/risposta.
- Inclinare il tubo di contenimento verso il soffitto mentre si cerca di caricare gli animali, poiché tendono a correre verso l'alto, cercando di scappare. Puntare i tubi verso il basso durante il caricamento incoraggerà a girarsi e a fuoriuscire dalla parte posteriore del tubo. Assicurarsi che il naso del mouse sia orientato verso l'estremità appuntita del tubo e fissare lo stantuffo a posizione variabile nell'estremità posteriore del sistema di ritenuta.
NOTA: Lo stantuffo è sagomato per consentire alla coda del mouse di sporgere dal supporto, il che consente al mouse di regolare la temperatura corporea mentre si trova nel trattenere.
- Regolare lo stantuffo per consentire ai topi di ruotare ma non girare dalla testa alla coda per garantire che l'aerosol venga inalato.
- Monitorare continuamente i topi mentre si trovano nei tubi di contenzione. Dopo aver posizionato lo stantuffo, i topi piccoli (<20 grammi) spesso tentano di girare dalla testa alla coda nei tubi e di adottare una posizione a U dove hanno difficoltà a respirare. Questo comportamento di svolta è più diffuso nei primi 5 minuti di contenzione; Dopodiché, i topi raramente tentano di girare la testa contro la coda.
3. Erogazione di aerosol
- Inserire i tappi per tappare le porte di erogazione dell'unità di inalazione e attivare il generatore di aerosol, il controller del flusso di aria compressa e la pompa del vuoto dell'unità di inalazione dall'interno del software di controllo del processo.
- Una volta che le letture del monitor per aerosol in tempo reale dimostrano che la concentrazione di aerosol deve raggiungere l'equilibrio (~30 min, Figura 2), iniziare a rimuovere i tappi e inserire i tubi di contenimento solo per il naso contenenti topi nell'unità di inalazione. Ripetere fino a quando tutti i topi esposti al farmaco sono collegati all'unità di inalazione.
NOTA: Nell'esperimento di esempio, il flusso d'aria totale fornito all'unità di inalazione tramite il generatore di aerosol e l'aria di diluizione è impostato per fornire una portata di 0,5 L/min a ciascuna porta di esposizione dell'animale in uso. Ad esempio, un flusso d'aria totale di 15 L/min è sufficiente per alimentare ciascuna delle 30 porte dell'unità di inalazione. Si tratta di un flusso d'aria molto maggiore di quello richiesto dalla ventilazione minuziosa dei topi, ma è necessario un flusso d'aria maggiore per fornire l'energia (caduta di pressione attraverso il generatore di aerosol) per produrre (atomizzare/deagglomerare) l'aerosol.
- Una volta caricati tutti gli animali nell'unità di esposizione, accendere le pompe di campionamento a vuoto collegate al filtro assoluto e all'impattatore a cascata utilizzando il software di controllo del processo.
- Quando tutte le esposizioni sono completate, spegnere il generatore di aerosol e rimuovere i topi rimanenti dall'unità di inalazione.
NOTA: Gli animali saranno gestiti in un capote della stazione di cambio o da personale che indossa una maschera facciale. Dopo la conclusione dell'erogazione dell'aerosol, i topi vengono rimossi dai tubi e sanificati dopo ogni utilizzo.
