$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
Usa topi donatori Balb/cYJ (H2d) e topi riceventi C57Bl/6 (H2b) per esaminare le reazioni allogeniche. I topi sono usati per esperimenti di età compresa tra 8 e 12 settimane. Usa topi femmina o maschio. I controlli singenici consistono in segmenti aortici da donatori C57Bl/6 a riceventi C57Bl/6.
1. Preparazione del donatore e del ricevente
NOTA: Sia il donatore che il ricevente vengono anestetizzati e preparati prima dell'intervento chirurgico per ridurre al minimo l'ischemia dell'innesto. Nel protocollo vengono utilizzati anestetici iniettabili per prevenire l'ostruzione dell'animale da parte delle apparecchiature necessarie per la somministrazione di anestetici per via inalatoria. Tuttavia, se lo si desidera, un anestetico per via inalatoria è un'alternativa appropriata. Dall'iniezione iniziale degli anestetici, l'intera procedura richiede circa 90 minuti per essere completata. Il tempo ischemico dell'innesto è inferiore a 30 min.
- Anestetizzare il topo con iniezioni intraperitoneali di ketamina (100 mg/kg; 10 mg/ml) e xilazina (10 mg/kg; 1 mg/ml). Il topo verrà sedato entro 10-15 minuti. Valutare la profondità dell'anestesia pizzicando la parte grassa del cuscinetto del piede dell'animale. Somministrare 1/3 della dose originale del cocktail anestetico, secondo necessità, fino a quando l'animale non mostra un riflesso di astinenza. Monitorare attentamente la frequenza respiratoria dopo la somministrazione di ogni cocktail. Durante l'intervento chirurgico, valutare il livello di anestesia ogni 15 minuti pizzicando la parete addominale anteriore con un paio di pinze. I topi devono rimanere profondamente anestetizzati per 60-90 minuti.
- Lubrificare gli occhi del topo con un unguento oftalmico per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Radere i peli il più vicino possibile alla pelle nella regione ventrale addominale dalla metà del torace al pube. Prestare particolare attenzione a non intaccare la pelle. Non utilizzare creme depilatorie perché potrebbero essere assorbite dalla pelle e potrebbero essere infiammatorie.
- Posiziona l'animale supino su un asciugamano sopra il tavolo riscaldante o il pad.
- Pulire il sito chirurgico con uno scrub preliminare con cloroesidina al 2%. Preparare un'ampia area di lavoro per massimizzare il campo chirurgico. Inizia a strofinare al centro del sito chirurgico e spostati verso l'esterno in modo lineare o circolare. Smaltire la garza. Ripetere questa procedura almeno altre 5 volte. Applicare un tampone per la preparazione dell'alcol sulla stessa area. Una volta che l'alcol è asciutto, preparare l'area pulita con la soluzione di Betadine e coprirla con una garza sterile.
2. Procedura di Anastomosi End-to-End
- Operazione del donatore
- Mantenere una tecnica asettica per tutta la durata dell'operazione. Pulire tutte le superfici del piano di lavoro e del tavolo chirurgico con una soluzione di perossido di idrogeno accelerato allo 0,5% prima dell'uso. Avvolgere e sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici, le garze, i teli e i camici prima dell'uso. Verificare la sterilità degli strumenti con una striscia indicatrice per sterilizzatore a vapore posta in ogni confezione. I guanti chirurgici sterili vengono utilizzati e smaltiti tra un intervento chirurgico e l'altro. Per più interventi chirurgici, sterilizzare gli strumenti chirurgici tra un utilizzo e l'altro con lo sterilizzatore a perle di vetro caldo.
- Posizionare il topo donatore supino su una tavola di plexiglas pulita e sottile avvolta con un telo sterile sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento 8-30X.
- Dopo aver assicurato un'adeguata anestesia chirurgica come descritto nella sezione 1.1, procedere con l'intervento chirurgico.
- Utilizzando le forbici sterili, praticare un'unica incisione longitudinale longitudinale inferiore della linea mediana, dal pube al processo xifoideo.
- Aprire le pareti addominali per esporre la cavità utilizzando un piccolo divaricatore.
- Utilizzando applicatori sterili con punta di cotone, ritrarre delicatamente l'intestino superiormente alla sinistra dell'animale e coprire con una garza inumidita con soluzione salina. Muovi gli organi riproduttivi inferiormente e individua l'aorta infrarenale e la vena cava inferiore (IVC). Inumidire periodicamente i tessuti esposti con una soluzione salina.
- Utilizzando la pinza medica n. 5, separare l'aorta dall'IVC, dal livello dell'arteria renale sinistra alla biforcazione. Utilizzare suture monofilamento di poliammide 10-0 per legare i piccoli rami vicino all'aorta.
- Una volta che l'aorta del donatore è stata separata dall'IVC, saturare il vaso con soluzione fisiologica, coprire la cavità esposta con una garza inumidita e mettere da parte il donatore in un'area sterile. Controllare lo stato del donatore (funzione respiratoria e cardiovascolare e profondità dell'anestesia) ogni 15 minuti. Iniziare a operare sul ricevente, isolando l'aorta come descritto di seguito (Passaggi da 2.2.1 a 2.2.7).
- Una volta che l'aorta ricevente è stata separata dall'IVC e messa da parte, riportare il donatore al microscopio. Clamp trasversale (prossimale e distale al segmento di interesse) l'aorta del donatore, a circa 5 mm di distanza, con due clamp microvascolari da 4 mm.
- Utilizzando le microforbici Vannas-Tubingen, sezionare un piccolo segmento di innesto (lungo da 3 a 4 mm) dell'aorta addominale.
- Utilizzando un ago da 25 G 5/8 collegato a una siringa, lavare l'aorta asportata con una soluzione salina eparinizzata (100 U/ml). Assicurarsi che la punta dell'ago non entri in contatto con il recipiente.
- Mettere l'aorta in una soluzione salina eparinizzata (100 U/ml) su ghiaccio e mettere da parte. Mentre si è ancora in anestesia profonda, rilasciare le pinze microvascolari. Eutanasia del donatore per dissanguamento.
- Impiantare il vaso donatore entro 30 minuti dall'escissione. Sebbene sia possibile utilizzare un vaso donatore per più riceventi asportando una lunghezza maggiore dell'aorta, mantenere il tempo ischemico a meno di 30 minuti.
- Operazione del destinatario
- Mantenere una tecnica asettica per tutta la durata dell'operazione, come nell'operazione del donatore.
- Posizionare il topo ricevente supino su una sottile tavola di plexiglas avvolta con un telo sterile sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento di 8-30X.
- Dopo aver assicurato un'adeguata anestesia, procedere con l'intervento chirurgico quando l'animale non mostra riflesso di ritiro.
- Utilizzando le forbici sterili, praticare un'unica incisione longitudinale longitudinale inferiore della linea mediana, dal pube al processo xifoideo.
- Aprire le pareti addominali per esporre la cavità utilizzando un piccolo divaricatore.
- Utilizzando applicatori sterili con punta di cotone, ritrarre delicatamente l'intestino superiormente alla sinistra dell'animale e coprire con una garza inumidita con soluzione salina. Muovi gli organi riproduttivi inferiormente e localizza l'aorta infrarenale e l'IVC. Inumidire periodicamente i tessuti esposti con una soluzione salina.
- Separare l'aorta dall'IVC, dal livello dell'arteria renale sinistra alla biforcazione. Utilizzare suture monofilamento di poliammide 10-0 per legare i piccoli rami vicino all'aorta, se necessario.
- Clamp a croce (prossimale e distale al segmento di interesse) l'aorta, a circa 5 mm di distanza, con due morsetti microvascolari da 4 mm.
- Utilizzando le microforbici di Vannas-Tubingen, eseguire un'unica aortotomia orizzontale e resecare un piccolo segmento (non più di 0,5 mm) dell'aorta addominale per accogliere l'innesto aortico del donatore.
- Lavare l'aorta asportata con una soluzione salina eparinizzata (100 U/ml). L'innesto aortico del donatore deve essere di lunghezza adeguata per collegare le estremità aortiche sezionate del ricevente.
- Posizionare l'innesto aortico del donatore in posizione ortotopica e anastomizzare l'estremità dell'innesto del donatore con l'estremità del ricevente, facendo corrispondere il rispettivo orientamento anatomico dell'innesto con quello del ricevente.
- Afferrare delicatamente la tunica esterna del vaso ed estroflesse leggermente utilizzando la pinza medica n. 5. Usando la pinza, guidare l'ago attaccato alla sutura monofilamento di poliammide 10-0 attraverso l'intero spessore della parete del vaso per fissare l'innesto aortico del donatore al vaso resecato del ricevente. Assicurarsi che l'apertura del recipiente non sia chiusa a causa di cuciture involontarie della parete posteriore del recipiente.
- Per punti continui, posizionare le suture a ore 9 sia nell'estremità superiore che in quella inferiore dell'innesto. Partendo dall'estremità superiore dell'innesto a partire dalle ore 3, anastomizzare le estremità resecate con 2 punti di sutura in esecuzione e fissare la sutura alla sutura di sostegno.
- Capovolgere l'innesto e continuare la sutura in esecuzione fino alla parte dorsale del vaso, incontrando la sutura di supporto di origine. Fissare senza esercitare molta pressione sul recipiente. Ripetere la sutura per l'anastomosi inferiore.
Nota: le suture interrotte iniziano allo stesso modo delle suture continue, tranne per il fatto che il vaso è anastomizzato con tre punti separati tra le suture di sostegno. Il tempo di anastomosi è solitamente di 20 minuti.
- Una volta completata l'anastomosi, rilasciare il morsetto microvascolare distale per consentire il flusso di sangue retrogrado e verificare la presenza di perdite nei siti anastomizzati. In caso di perdite, posizionare immediatamente un punto per chiudere il sito difettoso. Se non ci sono sanguinamenti nei siti, rilasciare il morsetto prossimale.
- Esaminare il trapianto e verificare che non vi siano ostruzioni di sangue nell'innesto e nelle porzioni prossimali e distali del vaso del ricevente. Un modello di pulsazione vigoroso nei vasi del donatore e del ricevente indica che il sangue scorre liberamente. Usando il paio di pinze, afferrare delicatamente un'estremità delle suture di stazionamento ed estroflesse leggermente il vaso per ispezionare la parete posteriore del vaso.
nota: Non ci dovrebbero essere increspature della parete del vaso ad entrambe le estremità dei siti anastomosizzati. Uno scarso flusso sanguigno dopo la rimozione delle pinze è un segno di trombosi.
- Rimetti l'intestino nella cavità addominale usando applicatori con punta di cotone.
- Con il porta-aghi Castroviejo e la pinza Graefe, chiudere la parete addominale con suture in polipropilene 5-0 utilizzando la cucitura continua. Chiudere lo strato cutaneo con le stesse suture utilizzando la chiusura sottocuticolare.
- Somministrare Torbugesic (1 mg/kg) i.m. immediatamente dopo il completamento del trapianto.
- Somministrare immediatamente, nell'ordine, Atipamezolo (1 mg/kg), ketoprofene (5 mg/kg) e la soluzione di Ringer lattato riscaldata per via sottocutanea.
- Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, mettere i topi in una gabbia riscaldata sotto una coperta d'acqua per una notte (12 ore). Durante il periodo di recupero dall'anestesia, posizionare gli animali da soli in un'area pulita, asciutta e senza ostacoli. Foderare la gabbia (sterilizzata in autoclave) con carta assorbente pulita e regolare la temperatura della coperta d'acqua a circa 20-22 °C. Fornire crocchette asciutte e bagnate ad libitum sul pavimento della gabbia.
nota: Una componente essenziale dell'assistenza post-chirurgica è l'osservazione dell'animale e l'intervento appropriato, se necessario, durante il recupero dall'anestesia e dall'intervento chirurgico. L'intensità del monitoraggio necessaria varierà a seconda dell'animale e potrebbe essere maggiore durante il periodo di recupero anestetico immediato rispetto al successivo recupero postoperatorio.
- Monitorare continuamente gli animali che sono stati sottoposti ad anestesia fino a quando non si riprendono completamente. L'animale deve essere in grado di mantenere la decubito sternale non assistita e deve apparire calmo e privo di dolore prima di essere lasciato incustodito.
- Somministrare Buprenorfina (0,1 mg/kg BID) e ketoprofene (5 mg/kg SID) per tre giorni, entrambi per via sottocutanea.
- Monitorare la funzione cardiovascolare e respiratoria, la temperatura corporea e il dolore o il disagio postoperatorio durante il recupero dall'anestesia per almeno tre giorni. Potrebbe essere necessaria un'assistenza aggiuntiva, come la somministrazione di analgesici e altri farmaci e fluidi parenterali per ridurre al minimo la disidratazione e la perdita di elettroliti.
- Valutare il successo dell'intervento di trapianto osservando la funzione motoria degli arti posteriori. Il completo successo del trapianto comporta un flusso sanguigno senza ostacoli all'arto posteriore e alla coda, che dovrebbe essere immediato dopo il recupero dell'animale, e il pieno recupero senza paralisi degli arti posteriori il secondo giorno.