Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione chirurgica, anestesia e regime di analgesia
- Posizionare un telo sterile monouso (45,7 cm x 66 cm) sulla piattaforma chirurgica. Afferrare delicatamente il topo, iniettare ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) per via intraperitoneale (i.p) per l'anestesia e iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea per l'analgesia.
- Garantire la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi, radere i peli in tutta l'area dell'addome con un rasoio e posizionare il mouse sulla piattaforma chirurgica sterile sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento di 6-10x.
2. Prelievo della milza del donatore
- Sterilizzare l'addome con un tampone imbevuto di alcol, fissare gli arti con nastro chirurgico e praticare un'incisione cutanea verticale di 3-4 cm sulla linea mediana dal pube al processo xifoideo con le forbici.
- Ritrarre la parete addominale con divaricatori sterili ricavati da graffette. Sposta l'intestino sul fianco destro dell'addome (lato sinistro del chirurgo) con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza. Cauterizzare la vena gastrica corta attaccata alla milza con un cauterizzatore sterile a bassa temperatura (Figura 1A). Mettere un pezzo di garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica a 37 °C sulla milza per mantenerla umida (Figura 1B).
- Separare e mobilizzare la vena porta dal tessuto pancreatico (Figura 1C) legando i rami della vena porta (vena pancreatico duodenale superiore e vena gastrica destra); posizionare una sutura attorno alla vena porta distale dalla vena splenica (Figura 1D).
- Capovolgere la milza sul lato destro per esporre l'aorta e il tronco celiaco con l'arteria splenica (Figura 1E). Sezionare e mobilizzare l'arteria aortica-celiaca-splenica legando l'arteria epatica e l'arteria gastrica; posizionare una sutura attorno all'aorta prossimale all'arteria celiaca (Figura 1F-G).
- Iniettare 100 unità internazionali (UI) di eparina nella vena cava inferiore (IVC) per eparinizzare tutto il corpo e attendere 3 minuti per assicurarsi che l'eparina abbia effetto. Legare l'aorta prossimalmente all'arteria celiaca, sezionare la vena porta e quindi perfondere l'intero corpo utilizzando 10 mL di soluzione salina eparinizzata a freddo (4 °C) (10 mL/20 s) dall'aorta addominale distale al tronco celiaco (Figura 1H).
- Raccogliere l'innesto di milza in blocco con il segmento aortico-celiaco-splenico associato e la vena porta insieme a un segmento di vena splenica e una piccola porzione di tessuto pancreatico. Conservare l'innesto in 5 mL di soluzione fisiologica a 4 °C prima del trapianto. Eutanasia del topo mediante lussazione cervicale.
3. Splenectomia del ricevente e impianto di innesto di milza
- Posizionare un termoforo sulla piattaforma chirurgica e regolare la temperatura a 37 °C. Posizionare un telo sterile (45,7 cm x 66 cm) sopra il termoforo per creare una piattaforma chirurgica sterile. Ripetere i passaggi 2.1 e 2.2 per la preparazione chirurgica e l'anestesia. Praticare un'incisione della linea mediana di 3-4 cm e ritrarre la parete addominale come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2.
- Spostare con cautela l'intestino sul lato destro del topo con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza del ricevente. Legare la vena splenica e l'arteria e rimuovere la milza.
- Spostare con cautela l'intestino sul lato sinistro del topo e coprire l'intestino con una garza bagnata (imbevuta di soluzione fisiologica sterile a 37 °C). Sezionare e legare i rami lombari dell'aorta infrarenale e dell'IVC; bloccare l'aorta infrarenale e l'IVC utilizzando due pinze microvascolari da 4 mm.
- Posizionare una sutura di nylon 11-0 attraverso l'aorta infrarenale (a tutto spessore) e ritrarla per creare un'aortotomia ellittica con un singolo taglio con microforbici (la lunghezza deve corrispondere al diametro dell'aorta del donatore, Figura 2A). Forare l'IVC utilizzando un ago da 30 G per creare una venotomia ellittica ed estendere l'apertura alla lunghezza corrispondente della vena porta del donatore utilizzando microforbici (Figura 2A).
- Eliminare il sangue intraluminale o il coagulo di sangue (nell'aorta e nell'IVC) con 500 μL di soluzione salina eparinizzata (10 unità/mL).
- Posizionare l'innesto di milza nel fianco destro dell'addome del topo ricevente; identificare attentamente la cuffia aortica del donatore e la vena porta del donatore. Dopo essersi assicurati che i vasi non siano attorcigliati, coprire l'innesto di milza con una garza imbevuta di soluzione fisiologica fredda (4 °C).
- Collegare la cuffia aortica del donatore all'apice prossimale e distale dell'aortomia del ricevente con due suture di soggiorno (sutura in nylon 11-0, come di seguito) (Figura 2B, C). Effettuare un'anastomosi con 2-3 morsi di suture continue in nylon 11-0 tra la cuffia aortica del donatore e l'aortotomia del ricevente (parete anteriore) (Figura 2D). Capovolgere l'innesto di milza sul lato sinistro del ricevente; effettuare l'anastomosi tra la cuffia aortica del donatore e l'aortotomia del ricevente (parete posteriore) (Figura 2E).
- Eseguire un'anastomosi per collegare la vena porta del donatore alla parete posteriore dell'IVC del ricevente, utilizzando da 4 a 5 morsi di suture continue all'interno dell'IVC e quindi chiudere la sutura all'esterno dell'IVC (Figura 2F, G).
- Rilasciare le pinze dei vasi e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per tamponare l'emorragia fino a quando il colore della milza non viene recuperato (Figura 2H).
- Chiudere l'addome con una sutura sintetica riassorbibile 5-0 in vicryl in uno schema continuo. Chiudere lo strato cutaneo con una sutura di nylon 5-0 in uno schema interrotto.
nota: Per le fasi 3.7-3.8, in alternativa, effettuare prima un'anastomosi tra la vena porta del donatore e l'IVC della ricevente (fase 3.8); Quindi eseguire un'anastomosi tra la cuffia aortica del donatore e la parete posteriore dell'aortotomia del ricevente, utilizzando 2 o 3 suture continue all'interno dell'aorta e chiudere la sutura all'esterno dell'aorta.
4. Recupero degli animali
- Iniettare 1 mL di soluzione fisiologica calda per via sottocutanea attraverso 4 posizioni separate (0,25 mL/posizione) dopo aver chiuso l'addome.
- Tenere il mouse in un'incubatrice a temperatura controllata (30 °C) per le prime ore dopo l'operazione, monitorare il mouse fino a quando non ha ripreso sufficiente coscienza, quindi trasferire il mouse in una nuova gabbia pulita con cibo e acqua regolari, con un cuscinetto riscaldante (30 °C) sotto la gabbia. Tenere il topo dopo l'intervento chirurgico in una gabbia separata.
5. Gestione del dolore post-operatorio
- Iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea 24 ore e 48 ore dopo l'intervento chirurgico per mantenere il regime di analgesia.
