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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di stock di glicerolo quantificato di Bacillus calmette-guerin (BCG) danese e Mycobacterium tuberculosis H37Rv
NOTA: Tutti i protocolli descritti sono stati eseguiti in condizioni di livello di bio-sicurezza-3 (BSL3).
- Scongelare le scorte di glicerolo congelate di ceppi BCG danesi o H37Rv e inoculare 100 μl in 10 ml di terreno 7H9 integrato con Tween-80 0,05% (v/v) e ADC (albumina, destrosio, catalasi) 10% (v/v).
- Incubare in condizioni statiche per una settimana a 37 °C fino a quando la coltura non è in fase di crescita logaritmica.
- Aumentare la coltura batterica trasferendo la coltura da 10 ml in 200 ml di terreno fresco. Incubare per altri 20 giorni in condizioni statiche.
- Trasferire in provette da centrifuga da 50 ml e centrifugare per 15 minuti a 2500 x g.
- Scartare i surnatanti e risospendere il pellet batterico nel volume residuo. Aggiungere perle di vetro sterili di 3 mm di diametro a ciascuna provetta (10 - 15 per provetta).
- Agitare energicamente per 1 minuto in modo da dissociare i grumi batterici. Risospendere ogni pellet in 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Tween-80 0,05% (v/v).
- Lasciare i tubi per 10 minuti permettendo agli aggregati batterici più grandi e alle perle di vetro di depositarsi.
- Recuperare 9,5 ml di surnatante da ciascuna delle 4 provette contenenti piccoli grumi e singoli batteri e trasferire i volumi in un'unica provetta da centrifuga fresca da 50 ml (volume finale recuperato 38 ml). Centrifugare per 10 min a 400 x g.
- Recuperare 35 ml di surnatante (contenente principalmente singoli batteri) in un'unica provetta da centrifuga fresca da 50 ml e aggiungere 15 ml di PBS con glicerolo al 50% (v/v), ottenendo una concentrazione finale di glicerolo del 15% (v/v).
- Mescolare delicatamente e distribuire in aliquote da 1 ml in apposite provette per il congelamento. Conservare a -80 °C (un lotto fornisce circa 50 aliquote di stock di glicerolo).
- Per quantificare le scorte di glicerolo, scongelare il glicerolo il giorno dopo il congelamento ed eseguire sette diluizioni seriali di dieci volte in provette separate da 1,5 ml contenenti 900 μl di PBS.
- Piastra 100 μl di ciascuna diluizione in terreno solido-agar 7H10 integrato con ADC 10% (v/v) preparato in piastre di Petri di 55 mm di diametro.
- Aggiungere con cautela perle di vetro di 3 mm di diametro (circa 10 per piastra) e agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente il volume sulla piastra di agar. Scartare le perline e sigillare la piastra di agar con parafilm.
- Incubare per 21 giorni a 37 °C e determinare la concentrazione batterica contando le unità formanti colonie (CFU) nelle diluizioni in cui è possibile distinguere con precisione le singole colonie.
2. Vaccinazione del topo
- Scongelare un glicerolo BCG pre-quantificato e diluirlo in PBS per preparare due sospensioni. Calcolare il volume finale considerando che la dose per animale è di 100 μl per la somministrazione sottocutanea (10-7 CFU per ml per la vaccinazione sottocutanea) e di 40 μl per la somministrazione intranasale (2,5 x 10-7 CFU per la vaccinazione intranasale).
- Utilizzare una workstation di anestesia specializzata per roditori per anestetizzare i topi con una miscela di isoflurano e ossigeno. Utilizzare isoflurano al 5% per indurre l'anestesia e al 2% per mantenere i topi nella camera di anestesia. (È possibile utilizzare altri metodi di anestesia accettati).
- Per la somministrazione sottocutanea del vaccino, riempire una siringa da 1 ml con un ago da 26 G con 1 ml di sospensione batterica (10,7 CFU/ml). Rimuovere le bolle d'aria.
- Posizionare un topo anestetizzato su una superficie piana in posizione prona all'interno di una cappa a flusso laminare e inoculare per via sottocutanea 100 μl (10-6 CFU/dose) di vaccino in un fianco del dorso del topo. Rimetti il topo nella gabbia e monitoralo per assicurarti che si riprenda correttamente dall'anestesia.
- Cambiare l'ago della siringa tra ogni somministrazione di topo. Rimosse le bolle d'aria come descritto sopra.
- Per la somministrazione intranasale, posizionare un topo anestetizzato in posizione supina all'interno del cappuccio.
- Con una micropipetta prelevare 20 μl di sospensione con 2,5 x 107 CFU/ml. Posizionare l'inoculo goccia a goccia tra le due narici fino a quando l'intero volume non si è depositato, lasciando il tempo tra una goccia e l'altra per consentire al topo di respirare il volume in.
NOTA: i topi possono soffrire di distress respiratorio durante questa procedura, quindi dovrebbero essere lasciati ad assimilare ogni goccia prima di somministrare la successiva per prevenirla il più possibile.
- Riempire nuovamente la micropipetta con altri 20 μl e ripetere l'operazione. Se il topo inizia a svegliarsi dall'anestesia dopo la prima inoculazione, posizionarlo nella camera di anestesia prima della seconda. Rimetti il topo nella gabbia e assicurati che si riprenda correttamente dall'anestesia.
3. Sfida intranasale del topo con ceppo H37Rv
- Scongelare un glicerolo H37Rv pre-quantificato e diluirlo in PBS per preparare una sospensione batterica di 2.500 CFU per ml. Calcolare il volume finale considerando che la dose per animale è di 40 μl.
- L'H37Rv viene inoculato per via intranasale come descritto ai punti 2.5 - 2.7. La dose finale di provocazione per topo è di 102 CFU/40 μl.