Generazione della demielinizzazione corticale cerebrale diffusa in un modello di ratto

Abstract

Fonte: Üçal, M. et al., Rat modello di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie. J. Vis. Exp. (2021)

Il video dimostra un metodo per generare un modello di ratto con demielinizzazione corticale cerebrale diffusa. Ciò comporta l'interruzione della barriera emato-encefalica iniettando citochine pro-infiammatorie nei topi innescati con la proteina della guaina mielinica ricombinante. Questo processo facilita l'infiltrazione delle cellule immunitarie, con conseguente diffusa demielinizzazione corticale cerebrale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del materiale

NOTA: L'intervento viene condotto in condizioni asettiche. Prima di iniziare, assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici, comprese le punte da trapano, siano puliti con un disinfettante appropriato.

1. Preparare una miscela anestetica: 0,02 mg/mL di fentanil, 0,4 mg/mL di midazolam e 0,2 mg/mL di medetomidina (concentrazioni finali nella miscela).
   NOTA: Vedere la rispettiva sezione di discussione per anestetici alternativi.
2. Preparare una miscela di antidoto: 0,07 mg/mL di flumazenil e 0,42 mg/mL di atipamezolo (concentrazioni finali nella miscela).
3. Assemblare il catetere e il cappuccio del catetere con l'ingresso e la vite. Tagliare il catetere a una lunghezza di 2 mm con un bisturi (Figura 1).
   NOTA: Non utilizzare le forbici per questo poiché schiacciano e distorcono la forma della sezione trasversale circolare della punta del catetere.

2. Preparazione chirurgica

1. Anestetizzare il ratto mediante somministrazione intraperitoneale della miscela anestetica (1,5 ml/kg di peso corporeo).
2. Radi la testa del ratto tra le orecchie usando il rasoio elettrico. Posizionare una coperta omeotermica sul telaio stereotassico prima di posizionare l'animale, per evitare l'ipotermia durante l'intervento chirurgico.
3. Immobilizzare la testa del ratto nel telaio stereotassico utilizzando le barre auricolari e la piastra per il morso, assicurandosi che la testa sia orizzontale e stabile. Verificare la stabilità esercitando pressione sul cranio con il dito o con una pinza.
   NOTA: Un fissaggio allentato e un posizionamento non orizzontale all'interno del telaio stereotassico possono causare una deviazione dalle coordinate previste.
4. Applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico. Coprire gli occhi con un materiale opaco per evitare l'esposizione alla luce chirurgica.
5. Pulire la zona rasata alternando l'applicazione del complesso iodio-povidone al 70% e al 10%.
   NOTA: Seguire tutte le misure precauzionali durante l'intervento chirurgico per evitare infezioni. L'intervento viene condotto in condizioni asettiche. Se l'asepsi si interrompe, il materiale contaminato deve essere sostituito.

3. Impianto di catetere

1. Praticare un'incisione longitudinale di circa 2 cm di lunghezza al centro della pelle della testa. Usa i morsetti per bulldog per tenere la pelle ai lati. Per una panoramica di questi passaggi, vedere la Figura 2.
2. Rimuovere il sangue utilizzando un applicatore con punta di cotone.
3. Rimuovere il periostio del cranio. Pulire il fazzoletto con l'applicatore a punta di cotone ed esporre l'osso del cranio. Lasciare asciugare il teschio per circa 1 minuto.
4. Identificare i punti di riferimento anatomici, Lambda, Bregma e sutura mediale. Con la punta installata sul telaio stereotassico, posizionare la punta della punta sul Bregma come punto di partenza. Spostare 2 mm posteriormente dal Bregma e spostarsi di ~2,4 mm lateralmente alla sutura mediale.
5. Praticare un foro di 0,5 mm di diametro per il catetere in questa posizione. Sbuffare delicatamente la polvere d'ossa.
   NOTA: È importante che la dura madre rimanga intatta durante la perforazione. Per garantire ciò, 1) utilizzare un trapano che può essere installato sul telaio stereotassico, 2) ispezionare frequentemente il foro durante la perforazione e 3) perforare a piccoli passi. Se viene applicata troppa pressione al cranio, la punta del trapano continuerà a penetrare nel cervello e lo danneggerà completamente.
6. Praticare altri 3 fori (~1,3 mm di diametro) per le viti di ancoraggio a pochi millimetri di distanza dal primo foro. Soffiare via delicatamente la polvere d'ossa.
   NOTA: Selezionare le posizioni delle viti di ancoraggio che offrano spazio sufficiente per la parte superiore del catetere (~2 mm di diametro) e le parti superiori delle viti di ancoraggio (~1 mm).
7. Rimuovere la polvere ossea mediante irrigazione con circa 1 - 2 ml di soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS) o soluzione fisiologica utilizzando una siringa. Pulisci il cranio. Serrare le viti di ancoraggio di 2 - 3 giri completi.
   NOTA: Le viti di ancoraggio sono necessarie per stabilizzare l'allestimento tenendo in posizione il cemento dentale e, quindi, il catetere. Durante il serraggio di una vite di ancoraggio, assicurarsi che non sia facilmente rimovibile sollevandola delicatamente verso l'alto con una pinza. Poiché l'impianto del catetere stesso provoca un trauma tissutale, un'ulteriore lesione della dura madre durante la perforazione o il serraggio delle viti di ancoraggio porterà a lesioni traumatiche multiple e potrebbe ostacolare la comparabilità all'interno di un gruppo. Serrare prima le viti di ancoraggio e inserire per ultimo il catetere.
8. Inserire il catetere lungo 2 mm attraverso il primo foro, perpendicolare alla superficie del cranio. Tenendo ancora il catetere, applicare un po' di cemento dentale e lasciarlo polimerizzare con una breve esposizione (~5 s) alla lampada polimerizzante dentale per stabilizzare il catetere, consentendo l'uso di entrambe le mani nella fase successiva.
   cautela: Quando si lavora con una lampada fotopolimerizzante dentale, evitare di guardare direttamente la punta o la luce riflessa dall'area di applicazione, poiché l'elevata intensità di questa luce può causare danni alla retina. Utilizzare occhiali protettivi adeguati.
9. Applicare altro cemento dentale attorno al catetere, ancorare le viti e solidificare il cemento dentale con la lampada polimerizzante dentale (~15 - 30 s). Confermare l'indurimento del cemento con la punta di una pinza.

4. Chiusura della ferita e antagonizzazione dell'anestesia

1. Chiudere la pelle della testa con suture riassorbibili, anteriormente e posteriormente al catetere.
   NOTA: Poiché ci sarà una configurazione irregolare sul cranio alla fine dell'impianto, eseguire la chiusura della ferita di conseguenza. Sollevare troppo la pelle provocherà disagio per l'animale.
2. Iniettare la miscela di antidoto per via sottocutanea (1,5 ml/kg di peso corporeo) utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 26 g.
3. Somministrare enrofloxacina (2,5%) per iniezione sottocutanea (7,5 mg/kg di peso corporeo) per il trattamento antibiotico profilattico. Somministrare carprofene (1 mg/mL; 5 mg/kg di peso corporeo) e buprenorfina (1,2 mg/kg) per alleviare il dolore mediante iniezione sottocutanea.

5. Cure post-operatorie e farmaci

1. Rimettere l'animale nella gabbia modificata e tenerlo sotto osservazione per 1 - 3 ore, con un'applicazione di luce infrarossa per evitare l'ipotermia. Osservare e riposizionare costantemente l'animale ogni 5-10 minuti fino al recupero postoperatorio. Prestare particolare attenzione per evitare l'esposizione costante alla luce degli occhi fino al recupero.
2. Ripetere le somministrazioni di enrofloxacina (7,5 mg/kg di peso corporeo) e carprofene (1 mg/mL; 5 mg/kg di peso corporeo) mediante iniezioni sottocutanee il giorno dopo l'intervento chirurgico. La buprenorfina non è necessaria per essere rinfrescata poiché il trattamento precedente è efficace per 72 ore.

6. Preparazione della miscela di immunizzazione (non prima di 14 giorni dopo l'impianto del catetere)

NOTA: Metti le siringhe sul ghiaccio durante la procedura di preparazione.

1. Collegare due siringhe di vetro con punta Luer lock da 10 ml ai bracci corti di un rubinetto a 3 vie e chiudere la terza uscita con il braccio lungo.
2. Assicurarsi che le connessioni siano sicure e prive di perdite: aggiungere circa 4 ml di PBS sterile alla siringa aperta tenendo premuto il pistone 2. Inserire il pistone 1 e spingere entrambi i pistoni avanti e indietro controllando la presenza di perdite. Se non si verificano perdite, eliminare il PBS e rimuovere nuovamente il pistone 1.
3. Pipettare 1 mL di adiuvante di Freund incompleto (IFA) e 50 μg di glicoproteina oligodendrocitaria mielina ricombinante (rMOG_1-125) e regolare la miscela fino a un volume finale di 2 mL con PBS sterile (pH 7,4) in una provetta adatta.
   NOTA: A causa di perdite di emulsione sulle punte o sulle pareti delle siringhe durante la preparazione, preparare un volume maggiore di quello previsto per la somministrazione. Allo stesso modo, è più pratico prepararsi per più di 1 animale contemporaneamente.
4. Posizionare la miscela diluita di IFA e rMOG_1-125 nella siringa aperta. Inserire delicatamente il pistone mantenendo una pressione allentata sul pistone opposto (Figura 3A).
5. Emulsionare l'inoculo spingendolo da una siringa all'altra spingendo i pistoni avanti e indietro fino a renderlo bianco e viscoso (Figura 3B).
6. Fissare una siringa Luer lock da 1 ml al braccio corto aperto del rubinetto a 3 vie e riempirla con inoculo (Figura 3C). Distribuire tutto l'inoculo in siringhe da 1 ml. Tenerlo in ghiaccio fino all'iniezione. Somministrare la miscela il giorno della preparazione.

7. Immunizzazione

1. Anestetizzare il ratto con isoflurano in una camera (~2 min, miscelato con ossigeno 2 L/min) e quindi sostenere l'anestesia attraverso una maschera (miscelata con ossigeno 1,5 L/min).
2. Iniettare 200 μl di inoculo per via sottocutanea alla base della coda utilizzando un ago da 21 G.
   NOTA: Somministrare l'iniezione lentamente poiché la soluzione è viscosa.

8. Iniezione intracerebrale di citochine

1. Regolare la lunghezza della cannula del connettore (2 mm). (Vedere la Figura 4 per le fasi di preparazione.)
2. Riempire una siringa da 1 ml con la miscela di citochine (500 ng/μL di fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-alfa), 300 U/μL di interferone-gamma di ratto ricombinante (IFN-gamma) in PBS sterile). Collegare la siringa a una cannula connettore. Riempire la cannula con la miscela di citochine. Evita le bolle.
3. Montare la siringa sulla pompa a siringa programmabile e programmarla per iniettare 0,2 μl/min (Figura 5A). Avviare la pompa e mantenerla in funzione per evitare la formazione di bolle d'aria sulla punta della cannula.
   NOTA: La velocità di iniezione deve tenere conto del diametro interno della siringa specifica utilizzata; In questo modo, il diametro della siringa deve essere registrato durante l'impostazione della pompa.
4. Anestetizzare il ratto con isoflurano in una camera (~2 min, miscelato con 2 L/min di ossigeno) e quindi sostenere l'anestesia attraverso una maschera (miscelata con 1,5 L/min di ossigeno) (Figure 5B e 5C). Applicare colliri lubrificanti poiché l'animale sarà anestetizzato per almeno 30 minuti.
5. Rimuovere il tappo del catetere con l'ingresso. Inserire la cannula del connettore nel catetere e avvitarla e serrarla (Figure 5D e 5E).
   NOTA: Non serrarlo eccessivamente, poiché ciò distruggerebbe la punta superiore del catetere.
6. Lasciare procedere l'iniezione per 10 minuti (il volume totale di iniezione è di 2 μl). Arrestare la pompa. Lasciare la cannula all'interno del catetere per 20 minuti per consentire al volume iniettato di diffondersi completamente.
7. Svitare la cannula del connettore e rimuoverla lentamente per evitare l'effetto vuoto.
8. Riattaccare il tappo del catetere con l'ingresso e avvitarlo. Lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia in una gabbia.

Risultati

Figura 1: Preparazione del catetere. (A e B) La cannula guida e la cannula fittizia (cappuccio del catetere con ingresso) vengono assemblate e avvitate. (C) Quindi il catetere viene tagliato a 2 mm di dimensione con l'aiuto di un bisturi. L'osservazione al microscopio ha dimostrato che l'uso di forbici a tale scopo distorce la forma circolare della p...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ratti Agouti scuri maschi adulti (300 ±25 g)
Fentanil	Hameln pharma plus, Germania		Come fentanil citrato, 50 μg/ml
Midazolam	ERWO Pharma, Austria	50039017	5 mg/ml
Medetomidina	Orion Pharma, Finlandia		Come Medetomidina cloridrato, 1mg/ml
Flumazenil	Roche, Svizzera		0,1 mg/ml
Atipamezol	Orion Pharma, Finlandia		Come Atipamezol cloridrato, 5 mg/ml
10% complesso iodio-povidone	Mundipharma, Austria
Cemento dentale	Heraeus Kulzer, Germania	Codice 6603 7633
Soluzione salina fisiologica	Fresenius Kabi, Austria		0,9% NaCl
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich, Germania	P3813
Isofluorano	AbbVie, Austria
Collirio lubrificante	Thea Pharma, Austria
70% EtOH	Merck, Germania	1070172511	L'etanolo assoluto è stato diluito in ddH2O per la preparazione del 70% v/v
2,5% Enrofloxacina	Bayer, Germania		Antibiotici profilattici
Carprofene	Pfizer, Stati Uniti		Antidolorifici, 50 mg/ml
Interpolazione-20	Sigma-Aldrich, Germania	P9416
Pentobarbital	Richter Pharma, Austria		Pentobarbital sodico, 400 mg/ml
Interferone gamma	PeproTech, Stati Uniti	400-20
Fattore di necrosi tumorale alfa	Sistemi di ricerca e sviluppo, Stati Uniti	510-RT-050/CF
rMOG1-125	prodotto proprio presso il Centro di Medicina Molecolare, Karolinska Institute, Svezia		Glicoproteina oligodendrocitaria mielina di ratto ricombinante, aminoacidi 1-125 dall'N-terminale, disponibile anche in commercio: AnaSpec, AS-55152-500, USA
Coadiuvante di Freund incompleto	Sigma-Aldrich, Germania	F5506
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich, Germania	Codice: A9576
Soluzione di substrato di perossidasi	Laboratori Vector, Stati Uniti	SK-45000
Telaio stereotassico	David Kopf Instruments, Stati Uniti
Cateteri adatti alla risonanza magnetica	PlasticsOne, Stati Uniti	8IC315GPKXXC
Cannule fittizie	PlasticsOne, Stati Uniti	8IC315DCNSPC
Viti in plastica, adatte alla risonanza magnetica	PlasticsOne, Stati Uniti	8L080X093N01
Cannula del connettore	PlasticsOne, Stati Uniti	8IC313CXSPCC
Cacciavite con punta da 2 mm
Punta con prolunga dell'albero flessibile	Proxxon, Germania	N. 28 472, N. 28 706, N. 28 620,
Punta da trapano, rotonda, 0,5 mm	Hager & Meisinger, Germania	REF310 104 001 001 009
Punta da trapano, tortuosa, 1,3 mm	Hager & Meisinger, Germania	REF350 104 417 364 013
bisturi	Braun, Germania	BB510
Manico del bisturi	Strumenti per la scienza, Germania	91003-12
Applicatore con punta in cotone	Henry Schein Medical, Austria	900-3155
Forbici chirurgiche	Strumenti per la scienza, Germania	14101-14, 14088-10
Pinze chirurgiche	Strumenti per la scienza, Germania	11002-12, 11251-35
Morsetti Bulldog	Strumenti per la scienza, Germania	Codice: 18050-35
Coperta omeoretermica	Sistemi TSE, Germania
Lampada a infrarossi	Beurer, Germania	616,51
Lampada polimerizzante dentale	Guilin Woodpecker Medical, Cina
Sutura riassorbibile	Johnson & Johnson, Belgio	V792E
Pompa a siringa programmabile	World Precision Instruments, Stati Uniti	AL-1000
Guanti da esame
Camice chirurgico
Rasoio elettrico	Aesculap, Germania	GT420
Vaporizzatore per anestesia volatile	Rothacher Medical, Svizzera	CV 30-301-D
Fonte di ossigeno per vaporizzatore per anestetico volatile	Air Liquide, Austria	19.113
Camera per anestesia volatile	Rothacher Medical, Svizzera	PS-0347
Maschera per anestesia per ratti	Rothacher Medical, Svizzera	PS-0307-A
Siringa da 1 ml	Codan, Danimarca	RIFERIMENTO 62.1612
Ago per iniezione calibro 26	Braun, Germania	4657683
Ago calibro 20 per iniezione e immunizzazione di citochine	Braun, Germania	4657519
Siringhe in vetro con punta Luer lock	Poulten & Graf, Germania	7.140-37
Rubinetto a 3 vie	Becton Dickinson, Svezia	Codice 394600
Incubatore a 37°C	Kendro, Germania	50042301
Micropipette	Gilson, Stati Uniti	F167350