Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Sterilizzazione
- Disinfettare le pinze prima di raccogliere le teste prelevando una pinza pulita ed eseguendo la sterilizzazione a calore secco in forno a 200 °C per 1 ora. Autoclavare tutta la vetreria a 121 °C per 15 minuti prima dell'uso.
- Eseguire tutti i lavori descritti all'interno di un armadio di microbiologia di classe 2. Preparare tutti i reagenti secondo le istruzioni del produttore.
2. Raccolta campioni
- Nel macello, gli agnelli di Swaledale venivano macellati mediante stordimento con elettricità o con una pistola a otturatore prigioniero e dissanguati. Raccogliere le teste di agnello non più di 4 ore dopo la macellazione.
3. Preparazione delle teste
- Disinfettare la parte anteriore dell'agnello versando circa 100 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm sull'area del campione. Radere la parte anteriore della testa utilizzando un tagliacapelli elettrico e lavare l'area con 200 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm.
- Pulire l'area con etanolo e rotolo blu e coprire l'area del campione con una crema depilatoria per 35 minuti. Raschiare delicatamente la crema depilatoria utilizzando uno strumento raschiante e valutare l'area del campione. Se rimane una quantità significativa di peli, ripetere il processo di depilazione.
- Utilizzare altri 200 ml di soluzione di biossido di cloro per risciacquare l'area, quindi risciacquare con etanolo e pulire con un rotolo blu.
- Utilizzando un punzone per biopsia sterile da 8 mm, ritagliare campioni di pelle da 8 mm dall'area preparata. Rimuovere i campioni utilizzando una pinza sterile e un bisturi a 15 lame, assicurandosi che tutto il grasso cutaneo venga rimosso.
- Mettere i campioni in un barattolo sterile da 0,5 L riempito con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) sterile, quindi trasferirli in provette sterili da 50 ml con 50 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm, capovolgere due volte e lasciare sterilizzare per 30 minuti.
- Rimuovere i campioni dalla soluzione di biossido di cloro e lavarli mettendoli in una provetta da 50 ml riempita con 40 ml di PBS sterile. Una volta lavato, posizionare ogni singolo campione di pelle in un pozzetto separato di una piastra a 24 pozzetti.
- Aggiungere 350 μl di terreno preriscaldato mantenendo il campione all'interfaccia aria-liquido. La composizione dei terreni è la seguente: terreno MK (terreno 199 con sali di Hanks, L-glutammato e 1,75 mg/mL di bicarbonato di sodio) e F12 di Ham in rapporto 1:1, con aggiunta di siero fetale bovino (FBS, 10% v/v), fattore di crescita epidermico (EGF, 10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicillina-streptomicina (100 U/mL), e amfotericina B (2,5 μg/mL).
- Sigillare le piastre a 24 pozzetti con una sigillatura per piastre permeabile ai gas e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 per un massimo di 24 ore.
4. Mantenimento dei campioni di pelle
- Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare i campioni in 500 μl di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere terreni privi di antibiotici a ciascun campione e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 per 24 ore per rimuovere gli antibiotici residui nel campione.
- Se dopo 24 ore si sviluppano torbidità o infezioni fungine nei terreni privi di antibiotici, scartare il campione.
5. Preparazione dell'inoculo
- Preparare una provetta da 50 ml con 10 ml di brodo di soia triptico sterile. Prendi una piastra di agar fresco di S. aureus e usa un tampone per trasferire diverse colonie nel brodo. Incubare per 18 ore a 37 °C a 150 giri/min.
- Centrifugare a 4.000 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di PBS sterile. Ripetere due volte per garantire un adeguato lavaggio delle cellule.
- Regolare l'inoculo a 0,6 OD600 in PBS sterile. Confermare il carico dell'inoculo eseguendo un conteggio manuale su piastra vitale.
6. Infezione di campioni di pelle
- Preparare una nuova piastra a 24 pozzetti con 400 μl di terreno preriscaldato privo di antibiotici e aggiungere gli inserti a 24 pozzetti utilizzando una pinza sterile.
- Rimuovere il terreno dai campioni di pelle, lavare con 500 μl di PBS sterile e rimuovere il lavaggio. Utilizzare una pinza sterile per tenere delicatamente il campione sul fondo del pozzetto.
- Utilizzare una biopsia con punzone da 4 mm per creare un lembo centrale della ferita, perforando fino a una profondità approssimativa di 1-2 mm. Quindi, utilizzare un bisturi a 15 lame e una pinza sterile per tessuto dentato per rimuovere lo strato superiore del lembo della ferita. La variabilità delle dimensioni della ferita può influenzare l'esito dell'infezione e le unità formanti colonie (CFU) del punto finale.
- Una volta che tutti i campioni sono stati feriti, trasferirli negli inserti a 24 pozzetti utilizzando una pinza sterile. Pipettare 15 μl di inoculo batterico nel letto della ferita. Quindi, incubare per 24 ore a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2.
- Se sono necessari periodi di incubazione più lunghi, rimuovere il terreno e sostituirlo con terreno fresco ogni 24 ore e incubare nelle stesse condizioni.
