Una tecnica per l'editing genetico nelle cellule natural killer utilizzando CRISPR Cas9

Abstract

Fonte: Naeimi Kararoudi, M., et al. Generazione di cellule NK umane primarie ed espanse knock-out utilizzando ribonucleoproteine Cas9. J. Vis. (2018).

Questo video dimostra una tecnica per la modificazione genetica mediata da ribonucleoproteine Cas9 di cellule natural killer primarie (NK). Una ribonucleoproteina Cas9, costituita da un'endonucleasi Cas9 legata a un RNA guida (gRNA) formata dall'accoppiamento di basi di un RNA CRISPR (crRNA) e di un crRNA transattivante (tracrRNA), viene introdotta nelle cellule natural killer primarie tramite elettroporazione. La ribonucleoproteina prende di mira e scinde il DNA ospite nel sito bersaglio, portando al knockout genico attraverso la modifica del gene bersaglio attraverso il meccanismo di riparazione cellulare.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Purificazione ed espansione delle cellule NK umane

1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da Buffy Coat.
   1. Strato 35 mL di campione di buffy coat su 15 mL di Ficoll-Paque.
   2. Centrifugare a 400 x g per 20 minuti senza freno e prelevare il PBMC dall'interfaccia.
   3. Lavare tre volte i PBMC recuperati aggiungendo almeno un volume uguale di PBS, centrifugando a 400 x g per 5 minuti e aspirando il lavaggio PBC. La cellula NK può essere isolata in questa fase mediante RosettesSep.
2. Espandere le cellule NK stimolando con cellule feeder irradiate 10 x 10^{che esprimono 6} mbIL21 ai giorni 0, 7 e 14. Sostituire i terreni con RPMI freschi contenenti il 10% di FBS, l'1% di glutammina, l'1% di penicillina streptomicina e 100 UI/mL di IL-2 per l'intero volume del terreno a giorni alterni.

2. Progettazione e selezione del gRNA

1. Scegli i loci genomici specifici da colpire, utilizzando strumenti online, ad esempio NCBI, Ensemble.
   esempio.
   Descrizione: Ectodominio del recettore beta 2 (TGFBRR2) del fattore di crescita trasformante
   Visualizza record: PF08917
   Visualizza InterPro: IPR015013
   Posizione: 49 - 157 aa
   Sequenza bersaglio: esone 4 del gene TGFBR2 (ENSG00000163513)
2. Per progettare i gRNA, utilizzare gli strumenti web di progettazione CRISPR come http://crispr.mit.edu e "Benchling".
   1. Inserire la sequenza di DNA scelta al punto 2.1. Scegli l'uomo (hg 19) come genoma target. Le guide CRISPR (20 nucleotidi seguiti da una sequenza di protospacer adjacent motif (PAM): NGG) saranno scansionate dalla sequenza inserita in precedenza. Mostra anche possibili corrispondenze fuori bersaglio in tutto il genoma selezionato.
   2. Scegli i migliori tre gRNA che hanno il punteggio più alto, in base ai loro tassi on-target e off-target. Ad esempio, la Tabella 1 mostra gli RNA CRISPR progettati per colpire l'esone 4 del gene TGFBR2 suggeriti dagli strumenti web di progettazione CRISPR.
3. Ordina gli RNA CRISPR come crRNA sintetici specifici per la sequenza.
4. Ordinare a un RNA conservato e transattivante (tracrRNA) di interagire attraverso un'omologia parziale con il crRNA.

3. Progetta primer di screening per la delezione

1. Progettare primer che coprono i siti di scissione del gRNA per il saggio di mutazione T7E1.
2. Utilizzare primer ad almeno 100 bp di distanza dal sito di scissione previsto per garantire che piccole inserzioni-delezioni (indel) nel sito bersaglio dell'sgRNA appaiano su gel di agarosio all'1,5% dopo il test di mutazione. La Tabella 2 mostra i primer utilizzati per amplificare l'ectodominio TGFBR2.

4. Trasduzione di cellule NK umane primarie ed espanse

Nota: La trasduzione degli elementi Cas9/RNPs in NK avviene mediante elettroporazione utilizzando il sistema 4D come segue.

1. Preparazione delle cellule
   1. Per le cellule NK primarie, incubare le cellule NK appena isolate in un terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) in presenza di 100 UI/mL di IL-2 per 4 giorni ed eseguire l'elettroporazione al giorno 5. Sostituire il supporto a giorni alterni come descritto in precedenza e il giorno prima della trasduzione.
   2. Per le cellule NK espanse, stimolare le cellule al giorno 0 con cellule feeder irradiate in un rapporto di 1:1 ed eseguire l'elettroporazione al giorno 5 o 6 o 7. Sostituire il supporto a giorni alterni come descritto in precedenza e il giorno prima della trasduzione.
   3. Il giorno dell'elettroporazione, preparare un pallone T25 riempito con 8 mL di RPMI fresco contenente 100 UI/mL di IL-2 per le cellule sottoposte a elettroporazione e pre-incubare i palloni in un incubatore umidificato a 37 °C e CO₂ al 5%.
      nota: Le cellule scongelate o le cellule che hanno subito la 2a o 3a stimolazione possono essere elettroporate in qualsiasi momento dopo il loro recupero come descritto.
   4. Prelevare 3 - 4 × 10⁶ cellule per condizione per 26 μL di miscela di trasduzione.
      nota: L'altissima concentrazione di cellule NK nella soluzione di elettroporazione migliora la velocità di trasduzione.
   5. Lavare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere tutto l'FBS, che comunemente contiene attività della RNasi. Centrifugarli ogni volta a 300 x g per 8 minuti.
      nota: Considerare 7 condizioni di elettroporazione per Cas/RNP come singolo gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) e una combinazione di due gRNA (gRNA1+gRNA2, gRNA1+gRNA3, gRNA2+gRNA3) e un controllo senza Cas9/RNP.
2. Forma il crRNA:tracerRNA/complesso
   1. Risospendere i crRNA (gRNA1, gRNA2 e gRNA3) e il tracerRNA in una soluzione 1x TE fino a concentrazioni finali di 200 μM. Mescolare 2,2 μL di ogni gRNA da 200 μM con 200 μM di tracerRNA come mostrato nella Tabella 3.
   2. Riscaldare i campioni a 95 °C per 5 minuti e lasciarli raffreddare sul piano di lavoro a temperatura ambiente (15 - 25 °C). Conservare gli RNA risospesi e il crRNA: tracrRNA/complesso a -20 °C per un uso successivo.
3. Forma il complesso RNP
   Nota: Per risparmiare tempo, formare il complesso RNP durante la fase di lavaggio 4.1.5.
   1. Per la singola reazione duplex crRNA:tracrRNA, diluire l'endonucleasi Cas9 a 36 μM come mostrato dall'esempio nella Tabella 4.
   2. Per la trasduzione combinata di crRNA:tracrRNA duplex, diluire l'endonucleasi Cas9 a 36 μM come mostrato nell'esempio nella Tabella 5.
   3. Aggiungere lentamente l'endonucleasi Cas9 ai duplex di crRNA:tracrRNA facendo roteare la punta della pipetta, da 30 s a 1 minuto.
   4. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 - 20 minuti. Se non sei pronto per utilizzare la miscela dopo l'incubazione, mantieni la miscela sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
4. Elettroporazione
   1. Aggiungere l'intero integratore alla soluzione di elettroporazione P3 e mantenerla a temperatura ambiente.
   2. Risospendere il pellet cellulare (3 - 4 × 10⁶ celle dal passaggio 4.1.5) in 20 μl di soluzione primaria di elettroporazione 4D P3. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio.
      Nota: le cellule non devono essere lasciate a lungo in soluzione P3.
   3. Aggiungere immediatamente 5 μl di complesso RNP (Fase 4.3) alla sospensione cellulare.
   4. Aggiungere 1 μL di potenziatore di elettroporazione Cas9 da 100 μM alla miscela Cas9/RNP/cellule.
   5. Trasferire la miscela di Cas9/RNP/cellula in strisce di elettroporazione da 20 μl.
   6. Picchiettare delicatamente le strisce per assicurarsi che il campione copra il fondo delle strisce.
   7. Avviare il sistema di elettroporazione 4D e scegliere il programma EN-138.

Tabella 1. Tre gRNA progettati per colpire l'esone 4 dell'ectodominio TGFBR2 come crRNA sintetico.

gRNA NO.	Sequenza di gRNA	Ordinato come crRNA sintetico
gRNA1	5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3	/AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrCrUrArGrCrUrCrUrUrCrU/AltR2/
gRNA2	5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3	/AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrUrCrArCrArGrGrGrCrUrArCrUrArGrGrGrCrUrUrUrCrUrCrU/AltR2/
gRNA3	5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3	/AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/

Tabella 2. Primer utilizzati per amplificare il gene dell'ectodominio TGFBR2

TGFBR 2 ectodominio Primer FWD	5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3
TGFBR2 ectodominio Primer REV	5 GGG CCT BAVAGLIO AAT CTG CAT TTA 3

Tabella 3. Formare il complesso crRNA:tracrRNA/utilizzando 200 μM di RNA

componente	Quantità (uL)
200 μM di crRNA	2.2
200 μM di RNA tracciante	2.2
Buffer IDTE	5.6
Prodotto finale	10

Tabella 4. Per la singola reazione duplex crRNA:tracrRNA, diluire l'endonucleasi Cas9 a 36 μM.

componente	Quantità (μL)
Pbs	1
crRNA:tracrRNA duplex (dal passaggio 4.2)	2 (200 pmol)
Endonucleasi Alt-R Cas9 (61 μM)	numero arabo
Volume totale	5 ul

Tabella 5. Per la trasduzione combinata di crRNA:tracrRNA duplex diluiscono l'endonucleasi Cas9 a 36 μM.

componente	Quantità (μL)
Pbs	1
crRNA:duplex tracrRNA (es. gRNA1)	1 (100 pmol)
crRNA:duplex tracrRNA (es. gRNA2)	1 (100 pmol)
Endonucleasi Alt-R Cas9	numero arabo
Volume totale	5 μl

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RosetteSep™ Cocktail di arricchimento delle cellule NK umane	Tecnologie STEMCELL	Codice: 15065	Il cocktail di arricchimento di cellule NK umane RosetteSep™ è progettato per isolare le cellule NK dal sangue intero mediante selezione negativa.
Ficoll-Paque® PLUS	GE Healthcare - Scienze della vita	Codice 17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	Tecnologie DNA integrate	1072532	TracrRNA che contiene modifiche chimiche proprietarie che conferiscono una maggiore resistenza alla nucleasi. Si ibrida con crRNA per attivare l'enzima Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	Tecnologie DNA integrate		Prodotto sinteticamente come Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, basato sulla sequenza di gRNA progettato che ha come bersaglio il gene dell'interesse
Kit di rilevamento dell'editing del genoma Alt-R®	Tecnologie DNA integrate	1075931	Ogni kit contiene l'endonucleasi T7EI, il tampone di reazione T7EI e i controlli del saggio T7EI.
Platino® Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà	Invitrogen	Codice 11304-011
Sistema di nucleofori™ 4D	Lonza	Codice AAF-1002B
Proteina IL-2 ricombinante umana	Novartis	Codice 65483-0116-07
Kit 4D-Nucleofector™ X a cellula primaria P3	Lonza	V4XP-3032	Contiene vettore pmaxGFP™, soluzione di nucleolettore™, integratore, strisce di nucleocuvette™ a 16 pozzetti
Non targeting: siRNA personalizzato, standard 0,05 2mol ON-TARGETplus	Dharmacon	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nucleasi 3NLS	Tecnologie DNA integrate	1074181	Nucleasi Cas9
Manuale DNeasy® per sangue e tessuti	Qiagen	Codice 69504
Mini kit RNeasy	Qiagen	Codice: 74104
Calcein AM	ThermoFisher	Visualizzazione del materiale C3099
TGFβ	Bioleggenda	580706
Kit di controllo Alt-R® CRISPR-Cas9, umano	Tecnologie DNA integrate	1072554	Include tracrRNA, crRNA a controllo positivo HPRT, crRNA#1 a controllo negativo, HPRT Primer Mix e tampone duplex privo di nucleasi.
IDTE pH 7.5 (1X TE Soluzione)	Tecnologie DNA integrate	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Potenziatore di elettroporazione	Tecnologie DNA integrate	1075915	Cas9 Potenziatore di elettroporazione