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1. Generazione di vaccini influenzali vivi attenuati ricombinanti mediante genetica inversa
NOTA: Il protocollo dettagliato per la generazione di virus influenzali ricombinanti mediante genetica inversa è stato descritto da studi precedenti e non rientra nell'ambito di questo rapporto. In breve, il salvataggio dei vaccini antinfluenzali adattati al freddo (CAV) viene effettuato in una cabina di biosicurezza di classe II in contenimento di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e prevede le fasi descritte di seguito.
- Generare un vaccino antinfluenzale riassortante adattato al freddo utilizzando come sfondo il ceppo A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) adattato al freddo, nonché l'emoagglutinina (HA) e una neuraminidasi modificata (NA) del ceppo A/PR/8/34 (H1N1) (Figura 1A). La modifica nel gene NA consiste in una sostituzione basata su PCR di una sequenza conservata nel gambo proteico (residui da 65 a 72) con una breve sequenza di cDNA che codifica per il peptide SIINFEKL derivato dall'ovoalbumina di pollo (OVA) (Figura 1B). Il peptide SIINFEKL è un peptide altamente immunodominante nel contesto della risposta H-2b MHC di classe I ristretta dei topi C57BL/6.
- Piastra 106 cellule 293T per pozzetto in piastre a 6 pozzetti utilizzando DMEM 10% siero fetale bovino (FBS) integrato con penicillina/streptomicina all'1% (P/E).
- Preparare la miscela di trasfezione plasmidica: aggiungere 1 μg di ciascuno dei plasmidi che codificano per i cDNA per PB2, PB1, PA, NP, M, NS del ceppo dell'influenza A/Ann Arbor/6/60 e 1 μg dei plasmidi che codificano per NA-SIINFEKL e HA dell'influenza A/PR/8/34. Aggiungere il terreno essenziale Opti-minimal (Opti-MEM) preriscaldato (15 μl per un volume finale di 100 μl/pozzetto).
- Incubare la miscela di trasfezione per 30 minuti a RT.
- Aggiungere 100 μl di miscela di trasfezione/pozzetto e incubare per 16 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Sostituire il terreno cellulare con DMEM 0,3% BSA 1% P/E a 33 °C e 5% CO2 per 5 ore.
- Aggiungere 106 cellule di rene canino Madin-Darby (MDCK) permissive per l'influenza in dimetilsolfossido (DMSO) contenenti 1 μg/ml di tripsina da pancreas bovino trattate con L-1-tosilamide-2-feniletilclorometil chetone (TPCK-tripsina). Mantenere le co-colture 293T-MDCK per 2 - 3 giorni a 33 °C e 5% di CO2.
- Raccogliere i surnatanti delle co-colture cellulari MDCK-293T e chiarificarli mediante centrifugazione a 260 x g per 5 minuti.
