1. Generazione di sferoidi
- Preparare e sterilizzare in autoclave l'agarosio al 2% in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (ad es. 1 g di agarosio in 50 mL di 1x PBS) e in autoclave in stampi di gomma da 35 e 81 micropozzetti.
cautela: Evitare l'uso di agarosio a basso punto di fusione per generare i cilindri di agarosio per l'elaborazione immunoistochimica (IHC).
- Preparare calchi di agarosio
NOTA: I cilindri a 35 micropozzetti sono utilizzati per saggi di invasione, immunofluorescenza (IF) e isolamento cellulare. I cilindri a 81 micropozzetti sono utilizzati per saggi di citotossicità, IHC, isolamento cellulare ed estrazione di acido ribonucleico (RNA).
- Dopo che l'agarosio è stato sterilizzato in autoclave, lasciare raffreddare l'agarosio fuso a circa 60\u201270 °C. In una cappa per coltura cellulare, utilizzare una tecnica asettica e pipettare 500 μL di agarosio fuso in uno stampo di gomma da 81 micropozzetti per pozzetto o 330 μL in uno stampo di gomma da 35 micropozzetti per pozzetto.
cautela: Evitare di creare bolle durante la miscelazione o il pipettaggio dell'agarosio. Rimuovere eventuali bolle pipettando delicatamente.
- Dopo che l'agarosio si è solidificato, flettere con cura lo stampo di gomma per rimuovere il calco di agarosio da esso. A questo punto, mettete le mani sopra la piastra a pozzetti appropriata e lasciate che il getto di agarosio cada direttamente in un pozzetto della piastra a pozzetti.
nota: Flettere lo stampo in gomma in diverse posizioni per evitare una flessione eccessiva. Potrebbe essere utile flettere lo stampo di gomma e spingere delicatamente dal basso allo stesso tempo.
- Per equilibrare i cilindri di agarosio, aggiungere un terreno di coltura cellulare, costituito dal Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (2,5 mL/pozzetto per piastra a 12 pozzetti e 1 mL/pozzetto per piastra a 24 pozzetti). Mettere la piastra a pozzetti in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) e incubare per 1 ora.
- Nel frattempo, prepara la coltura cellulare per la semina.
nota: Il numero totale di semina cellulare per ogni calco di agarosio deve essere deciso dallo sperimentatore. Per le linee cellulari di carcinoma pancreatico primario murino, vengono seminate 35.000 cellule/35 micropozzetti e 81.000 cellule/81 micropozzetti (in media 1000 cellule/sferoidi) per tutti i saggi successivi. Il diametro medio di uno sferoide è di circa 150\u2012200 μm dopo 48 ore.
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare che circonda il calco di agarosio con una pipetta P1000 inclinando prima la piastra a pozzetti. Quindi rimuovere con cura il terreno nella camera di semina.
- Seminare con cura la sospensione di cellule tumorali preparata goccia a goccia nella camera di semina cellulare. Rimettere con cautela la piastra a pozzetti nell'incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) per 15 min.
nota: Durante questa fase le cellule si depositeranno nei micropozzetti del calco di agarosio.
- Aggiungere ulteriore terreno all'esterno del calco di agarosio (2,5 mL/pozzetto per piastra a 12 pozzetti e 1 mL/pozzetto per piastra a 24 pozzetti).
- Rimettere la piastra a pozzetti nell'incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) per 48 h.
nota: Di solito ci vogliono fino a poche ore prima che le cellule formino sferoidi nei micropozzetti. In generale, gli sferoidi delle cellule tumorali solide si formano dopo 24 ore e sono stabili dopo 48 ore. Tuttavia, questo può variare tra le diverse linee cellulari. Se necessario, cambiare il terreno di coltura cellulare inclinando con cautela la piastra a pozzetti con i calchi di agarosio e rimuovendo il terreno di coltura cellulare circostante con una pipetta P1000. Quindi aggiungere con cura il terreno fresco pipettandolo lungo la parete del pozzetto. Di solito non è necessario cambiare il supporto all'interno dei calchi a causa del suo piccolo volume e del rischio di rimuovere gli sferoidi.
2. Co-coltura con cellule T
- Risospendere il numero richiesto di cellule T in 75 μL (cast a 35 micropozzetti) o in 190 μL (cast a 81 micropozzetti) del terreno di coltura di cellule T appropriato (RPMI integrato con il 10% di siero fetale bovino e 100 unità/mL di penicillina/streptomicina).
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare che circonda il calco di agarosio con una pipetta P1000 inclinando prima la piastra a pozzetti. Quindi rimuovere lentamente e con attenzione il terreno all'interno del calco puntando delicatamente un angolo della camera di semina con una pipetta P200 mantenendo la piastra del pozzetto inclinata con l'altra mano.
- (Fase critica 1) Poiché esiste il rischio di rimuovere gli sferoidi, controllare la perdita di sferoidi confrontando il numero di sferoidi all'interno dei micropozzetti prima e dopo la rimozione del mezzo osservandolo al microscopio con un ingrandimento di 10x.
- Seminare con cautela la sospensione di cellule T goccia a goccia nella camera di semina del calco di agarosio tenendo la pipetta P200 a circa 0,5 cm sopra il gesso.
- (Passaggio critico 2) C'è il rischio di eliminare gli sferoidi durante l'aggiunta delle cellule T. Pertanto, è fondamentale aggiungere le cellule T molto lentamente e circa 0,5 cm sopra la camera di semina.
nota: Una possibilità per ridurre il numero di sferoidi eliminati è puntare la pipetta verso un angolo della camera di semina mentre si aggiungono le cellule T, rischiando così solo di eliminare gli sferoidi in questo angolo.
- Riposizionare con cautela la piastra a pozzetti nell'incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2) per 15 minuti.
- Estrarre la piastra a pozzetti dall'incubatrice e aggiungere un terreno di coltura cellulare fresco (terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con il 10% di siero fetale bovino e 100 unità/mL di penicillina/streptomicina) attorno all'agarosio colato pipettandolo lentamente lungo la parete del pozzetto.
- Rimettere la piastra a pozzetti nell'incubatore per colture cellulari per 48 ore.
