Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Procedura per l'Acufection
NOTA: La quantità ottimale di DNA e l'area della superficie della pelle bersaglio possono variare per i diversi geni e devono essere ulteriormente ottimizzate. Anche la forza di puntura e il numero di volte in cui allentare lo strato corneo della pelle possono variare a seconda dello spessore della pelle. Queste condizioni devono essere attentamente determinate dopo aver valutato il livello di espressione dei trascritti genici acufettati mediante qRT-PCR.
- Pesare i topi e somministrare tribromoetanolo (400 μg per g di peso corporeo) mediante iniezione peritoneale.
NOTA: Il 2,2,2-tribromoetanolo è un agente anestetico iniettabile che è stato comunemente usato nei topi. Le soluzioni sono ottenute sciogliendo un 2,2,2-tribromoetanolo di grado non farmaceutico (2,5 g) in acqua distillata (200 ml) contenente il 2,5% di 2-metil-2-butanolo.
- Utilizzare un unguento oftalmologico veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza in anestesia.
nota: L'effetto anestetico sarà indotto in 1 - 2 minuti. Controllare il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi per garantire una profondità sufficiente dell'anestesia prima dell'operazione.
- Radere la pelle del fianco dorsale e applicare una crema depilatoria per sciogliere le proteine della cheratina nel fusto del capello.
nota: L'uso di una crema depilatoria per rimuovere i peli faciliterà l'infusione del DNA nella pelle.
- Utilizzare batuffoli di cotone imbevuti d'acqua per rimuovere la crema depilatoria.
nota: La crema depilatoria è solubile in acqua. La rimozione completa della crema eviterà una superficie grassa e garantirà un migliore risultato di puntura.
- Utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di etanolo al 70% per disinfettare la superficie della pelle.
- Segnare l'area target (1 cm x 1 cm) sulla pelle depilata con uno stencil pre-misurato. nota: La marcatura del sito di destinazione aiuterà ad applicare il fascio di aghi su e giù all'interno di un'area definita. Questo è importante per garantire la consegna della stessa quantità di DNA su una superficie specifica per ridurre al minimo la variazione da esperimento a esperimento.
- Posizionare una goccia di 10 μl di DNA plasmidico (10 μg) sulla pelle marcata.
nota: La quantità di DNA per l'acfezione varia a seconda dei diversi geni e del tipo di vettore di espressione. La quantità di DNA utilizzata deve essere accuratamente titolata prima di condurre l'esperimento di interesse. Il 10 μL è una piccola goccia liquida e si adatta bene sulla pelle rasata e depilata senza rotolare verso il basso durante la puntura. Includere un gruppo di controllo di topi trattati con 10 μL di DNA vettore vuoto da confrontare con i topi infettati con il gene in studio.
- Tenere il fascio di aghi per agopuntura (Figura 1B) e pungere la superficie contrassegnata con un movimento su e giù per 100 volte o fino a quando l'umidità del DNA nel PBS sulla pelle scompare. nota: Può verificarsi un arrossamento della superficie della pelle. Evita di fare tagli profondi che sanguinano.
Il numero di movimenti di puntura su e giù sulla superficie della pelle viene determinato in modo operativo quando l'umidità del DNA nella PBS (10 μL) scompare sulla pelle. Abbiamo deciso 100 volte in 30 secondi perché ha dato i risultati più coerenti dai geni forniti dall'agofezione. Se applicabile, gli aghi possono essere riutilizzati per un massimo di 6 punture cutanee target (1 cm x 1 cm ciascuna). Sciacquare gli aghi con etanolo al 70% e PBS tra l'agofezione. Passare a nuovi aghi quando sono opachi o per DNA plasmidico diverso per evitare la contaminazione incrociata.
- Posiziona i topi acufetti su un termoforo per mantenere la temperatura corporea fino al risveglio.
- Rimetti i topi nella loro gabbia quando hanno ripreso sufficiente coscienza. nota: Tenere i topi acufetti in una gabbia separata (meno di 5 animali per gabbia) dalla gabbia dei topi non acufetti.
- Posizionare la bottiglia d'acqua e rimettere la gabbia nella rastrelliera IVC (gabbia ventilata individualmente).
2. Assistenza post-operatoria
- Per le prime 48 ore dopo la procedura, monitorare attentamente i topi per qualsiasi disagio, inclusi cambiamenti comportamentali (irrequietezza, agitazione o disturbi alimentari) o aspetto anormale (pelo ruvido o postura curva).
