Un test in vitro per valutare l'attività antitumorale delle cellule CAR T specifiche del tumore

In questo articolo

Abstract

Fonte: Kueberuwa, G., et al. Un modello di linfoma a cellule B di topo singenico per la valutazione preclinica delle cellule T CAR CD19. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra un test in vitro per convalidare l'attività delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR). Le cellule di linfoma a cellule B che esprimono l'antigene CD19 e la luciferasi citoplasmatica sono co-coltivate con cellule CAR T specifiche per CD19. Il legame del CAR al CD19 su un tumore induce le cellule CAR T a rilasciare citochine e tossine che causano citotossicità delle cellule tumorali. L'attività delle cellule CAR T viene valutata quantificando la citochina rilasciata e la diminuzione della bioluminescenza mediata dalla luciferasi nelle cellule tumorali.

Protocollo

1. Validazione in vitro dell'attività delle cellule T CAR

Cellule tumorali CD19+ bersaglio singenico con o senza espressione di luciferasi a una densità di 1 x 10⁴ cellule in 100 μL di terreno completo di cellule T (TCM)/pozzetto in una piastra di coltura tissutale con fondo a U a 96 pozzetti.
Aggiungere 1 x 10⁴ cellule T CAR CD19/pozzetto in un volume di 100 μL/pozzetto per ottenere un rapporto effettore/target (E:T) di 1:1,
nota: I rapporti E:T devono essere stabiliti per ogni costrutto CAR e linea cellulare bersaglio.
Utilizzare le cellule T da sole e le cellule tumorali da sole come controlli negativi e le cellule T stimolate da forbolo-miristato-acetato (PMA) (50 ng/mL) e ionomicina (1 μg/mL) come controllo positivo per il rilascio di interferone-gamma (IFNγ). Co-coltura di cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 16-24 ore.
Dopo la co-coltura, centrifugare le piastre a 500 x g per 5 minuti e raccogliere il surnatante per ulteriori analisi ELISA di IFNγ e IL-12p70.
nota: Questo può essere conservato a -80 °C.
Risospendere i pellet cellulari in 100 μL di PBS contenente luciferina (concentrazione finale di 1,5 mg/mL). Incubare le piastre per 10 minuti a 37 °C. Quindi misurare la luminescenza da ciascun pozzetto con un luminometro adatto.
nota: I tempi di esposizione devono essere ottimizzati per le linee cellulari e la densità. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 1a. La citotossicità ex-vivo delle cellule CAR T può essere modificata per esprimere luciferina mediante co-coltura con linee cellulari che esprimono l'antigene bersaglio. Quando le cellule T CAR uccidono le cellule bersaglio, viene rilasciata luciferina, quindi una riduzione del segnale luminometrico è correlata all'uccisione cellulare. Le cellule non trasdotte possono spesso avere un effetto sulla vitalità delle cellule bersaglio, in particolare per lunghi periodi di incubazione. Misurare la concentrazione di IFNγ murino e IL-12p70 nel surnatante secondo i protocolli ELISA del produttore. I risultati rappresentativi sono mostrati in (Figura 1b e 1c). L'attivazione ex-vivo di cellule CAR T mediante co-coltura con linee cellulari che esprimono l'antigene bersaglio può essere analizzata analizzando il contenuto del surnatante mediante ELISA. Il rapporto tra le cellule T CAR e le cellule bersaglio e la durata del periodo di co-coltura devono essere ottimizzati per ogni costrutto CAR, linea cellulare bersaglio e analita. Il trattamento con PMA e ionomicina può essere utilizzato come controllo positivo per confermare la qualità delle cellule T e la loro capacità di rispondere.

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Risultati

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Figura 1. Validazione dell'attività delle cellule T CAR. Le cellule αmCD19 CAR T sono state co-coltivate con cellule di linfoma A20 modificate per esprimere luciferasi (1 x 10⁴:1 x 10⁴) per 16 ore in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U. Dopo la co-coltura, le cellule sono state pellettate ed è stato raccolto il surnatante. A) Le cellule sono state ri-sospese...