Un test in vitro per la valutazione della citotossicità delle cellule natural killer contro le cellule tumorali

Abstract

Fonte: Baik, C. H., et al. Un test di citotossicità basato su piastra per la valutazione della funzione citolitica delle cellule natural killer placentari di ratto. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'esecuzione di un test di rilascio di lattato deidrogenasi per determinare la citotossicità delle cellule natural killer (NK) contro le cellule tumorali bersaglio. Il test quantifica il rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi citoplasmatico dalle cellule tumorali misurando l'assorbanza del prodotto di colore rosso formato.

Protocollo

1. Saggio di citotossicità: Protocollo di analisi

1. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo, trattata con coltura, per impostare la piastra come suggerito nella Tabella 1. Questa tabella mostra i controlli sperimentali e 3 set di colonne sperimentali NK. Questo può essere espanso fino a un totale di 10 colonne sperimentali NK in una piastra a 96 pozzetti.
2. Centrifugare la piastra del saggio a 250 x g per 4 minuti per assicurarsi che l'effettore e le cellule bersaglio siano in contatto. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 5 ore in un incubatore a camera umidificata a 37 °C, 5% CO₂ per ottenere un ampio contatto tra le cellule bersaglio e le cellule effettrici e la lisi delle cellule bersaglio da parte delle cellule effettrici.
   nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. 45 minuti prima della raccolta dei surnatanti, aggiungere 10 μl di soluzione di lisi 10x ai pozzetti di rilascio massimo di LDH della cella target (pozzetti 1E, 1F, 1G e 1H) e riposizionare la piastra nella camera umidificata.
4. Al termine del tempo di incubazione, centrifugare la piastra a 250 x g per 4 minuti. Utilizzando un pipettatore multicanale, trasferire 50 μL di aliquote da tutti i pozzetti a una piastra di saggio a fondo piatto da 96 pozzetti.
   nota: Non toccare il fondo dei pozzetti in modo che le cellule non vengano trasferite nella piastra di saggio fresca. Non utilizzare una piastra trattata con coltura come piastra di analisi fresca.

2. Crea un reagente per il saggio.

1. Dopo che il tampone per saggi ha raggiunto la temperatura ambiente, aggiungere 12 mL di tampone per saggi a un flacone di miscela per substrati. Capovolgere e agitare delicatamente fino a completo scioglimento. 1 flacone è sufficiente per due piastre a 96 pozzetti.
   nota: Il tampone di analisi deve essere protetto dalla luce durante lo scongelamento. Mescolare immediatamente prima dell'uso.
2. Aggiungere 50 μl di reagente del saggio a tutti i pozzetti della piastra del saggio dal passaggio 4.6. Coprire la piastra con un foglio per proteggerla dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
   nota: Il reagente del test appena prodotto deve essere conservato in un congelatore. Il reagente è valido per circa 8 settimane.
3. Aggiungere 50 μl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto. Leggere la piastra entro 1 ora dall'aggiunta della soluzione di arresto e registrare l'assorbanza a 490 nm.
   I dati rappresentativi sono riportati nella Tabella 2.

Tabella 1: Layout della piastra del saggio. TCS = Rilascio spontaneo di LDH da parte di cellule bersaglio (50 μL di cellule bersaglio + 50 μL di terreno cellulare bersaglio); TCM = Rilascio massimo di LDH della cellula bersaglio (50 μL di cellule bersaglio + 50 μL di terreno cellulare bersaglio); VCC = Controllo della correzione del volume (50 μL di terreno di coltura della cellula bersaglio + 50 μL di terreno di coltura della cellula NK); CMB = Culture Medium Background Control (50 μL di terreno di coltura di cellule bersaglio + 50 μL di terreno di coltura di cellule NK); ECSR = Rilascio Spontaneo di Cellule Effettrici (50 μL di cellule NK + 50 μL di cellule NK di terreno); EW = Pozzetti sperimentali (50 μL di cellule bersaglio + 50 μL di cellule NK).

1	numero arabo	3	4	5
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcs	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
Tcm	CMB	EW-1	EW-2	EW-3

Tabella 2: Dati grezzi sull'assorbanza di una piastra di saggio contenente i controlli sperimentali nelle colonne 1 e 2 e pozzetti sperimentali per misurare la citotossicità delle cellule NK placentari di ratti NP e RUPP rispetto alle cellule bersaglio YAC1.

1	numero arabo	3	4	5
		Np	RUPP	Np
0,615	0,484	0,473	0,463	0,471
0,586	0,484	0,458	0,474	0,469
0,61	0,486	0,464	0,459	0,469
0,605	0,55	0,524	0,526	0,543
0,576	0,504	0,519	0,502 0,528	00.528
0,565	0,512	0,515	0,513	0,531
0,563	0,581	0,526	0,508	0,519

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti	CELLTREAT	Codice 229190	sterile, fondo rotondo
Raschietto per celle	pescatore	8100241
Kit per il test di citotossicità non radioattiva Cytotox 96	Promega	G1780
Giri di velocità	Gibco	11875135	1640 Medio
Cella YAC-1	ATCC	TIB-160