1. Sintesi di triacrilato di policaprolattone (PCLTA)
- Asciugare 3,2 mL di triolo di policaprolattone (PCL) 400 Da per una notte a 50 °C in un pallone aperto da 200 mL a fondo tondo e carbonato di potassio (K2CO3) in un flaconcino di vetro a 90 °C.
- Mescolare il triolo con 6,4 mL di diclorometano (DCM) e 4,246 g di K2CO3 sotto argon.
- Miscelare 2,72 mL di cloruro di acriloil in 27,2 mL di DCM e aggiungere goccia a goccia alla miscela di reazione nel pallone per 5 minuti.
- Coprire la miscela di reazione con un foglio di alluminio e lasciarla indisturbata a temperatura ambiente per 24 ore sotto argon.
- Dopo 24 ore, filtrare la miscela di reazione utilizzando una carta da filtro su un imbuto Buchner sotto vuoto per eliminare i reagenti in eccesso.
- Precipitare il filtrato della fase 1.5 che contiene il polimero con estremità in etere etilico in a 1:3 (vol/vol) e rotavap a 30 °C per rimuovere l'etere etilico.
2. Formazione della polibolla
NOTA: L'iniezione di polimero nell'acqua deionizzata (DI) causerebbe la migrazione delle polibolle sul fondo della fiala con conseguente appiattimento del fondo. Utilizzare invece il 10% (wt/vol) di carbossimetilcellulosa (CMC) per riempire la fiala di vetro per evitare l'appiattimento delle polibolle.
- Preparare una soluzione di CMC al 10% (wt/vol) in acqua deionizzata.
- Riempire un flaconcino di vetro da 0,92 mL con 0,8 mL di CMC al 10% utilizzando una pipetta di trasferimento da 1 mL.
- Miscelare 1000 mg/mL di PCL da 14 kDa in DCM e sintetizzare PCLTA in 1:3 (vol/vol) per un volume totale di 200 μL o preparare 200 μL di 1000 mg/mL di poli-acido lattico-co-glicolico-diacrilato (PLGADA) da 5 kDa in cloroformio.
- Miscelare il 2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone (fotoiniziatore) con la miscela di polimero (PLGADA o PCL/PCLTA) in 0,005:1 (vol/vol).
- Caricare 200 μl di miscela polimerica in una siringa di vetro da 1 mL montata su una pompa a siringa collegata a un tubo di erogazione in acciaio inossidabile con un diametro interno di 0,016 pollici.
- Utilizzare un micromotore per controllare il movimento avanti e indietro del tubo polimerico per iniettare il polimero nel CMC al 10% nella fiala di vetro per formare la polibolla.
- Polimerizzare le polibolle sotto ultravioletto (UV) a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.
- Congelare le polibolle in azoto liquido e liofilizzare per una notte a 0,010 mBar di vuoto e a -85 °C.
- Separare le polibolle dalla CMC essiccata usando una pinza e lavare le polibolle con acqua deionizzata per rimuovere eventuali residui di CMC. Si noti che altri polimeri possono essere utilizzati, probabilmente con modifiche per alterare la cinetica di rilascio.
3. Modulazione del diametro della polibolla
- Riempire un flaconcino di vetro da 0,92 mL con CMC al 10% utilizzando una pipetta di trasferimento da 1 mL.
- Miscelare PCL/PCLTA in formato 1:3 (vol/vol) con 1000 mg/mL di PCL 14kDa e sintetizzare PCLTA. Miscelare il fotoiniziatore con una miscela polimerica in una massa di 0,005:1 (vol/vol).
- Caricare la miscela di polimeri in una siringa di vetro da 1 ml montata su una pompa a siringa collegata a un tubo di erogazione in acciaio inossidabile con un diametro interno di 0,016 pollici.
- Utilizzare un micromotore per controllare il movimento avanti e indietro del tubo polimerico per iniettare il polimero nel CMC al 10% nella fiala di vetro per formare la polibolla.
- Per ottenere polibolle con vari diametri, variare la velocità di dispensazione da 0,0005 a 1 μL/s.
- Scattare immagini della fiala con le polibolle di diametro variabile.
- Utilizzare ImageJ per quantificare il diametro delle polibolle e utilizzare la dimensione della fiala come scala.
4. Centrare il carico all'interno della polybubble
- Modulazione della viscosità PCL/PCLTA utilizzando K2CO3:
nota: La viscosità di PLGADA non deve essere modificata utilizzando K2CO3 perché la viscosità di 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL è sufficiente per centrare il carico.
- Aggiungere K2CO3 (che è stato isolato dopo la reazione PCLTA) alla PCLTA a concentrazioni variabili, tra cui 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL e 60 mg/mL.
- Misurare le viscosità dinamiche delle soluzioni modificando la velocità di taglio da 0 a 1000 1/s utilizzando la reometria.
- Iniettare manualmente il carico al centro (fare riferimento al passaggio 4.2 per preparare la miscela di carico) delle polibolle che si sono formate utilizzando le soluzioni PCL/PCLTA con diverse concentrazioni di K2CO3 (passaggio 4.1.1). Determinare la concentrazione ottimale di K2CO3 osservando quale soluzione del passaggio 4.1.1 può provocare la ritenzione del carico nel mezzo.
- Centratura del carico (già dimostrata fattibilità con piccole molecole) con CMC
- Miscelare il carico con il 5% (wt/vol) di CMC in un rotatore durante la notte per aumentare la viscosità del carico.
- Iniettare manualmente 2 μL di miscela cargo nella polibolla e procedere con l'indurimento UV a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.
- Congelare le polibolle in azoto liquido per 30 s e liofilizzare durante la notte a 0,010 mBar di vuoto e a -85 °C.
- Separare le polibolle dalla CMC essiccata utilizzando una pinza e lavare con acqua deionizzata per rimuovere eventuali residui di CMC.
- Tagliare la polibolla a metà e visualizzare le metà utilizzando la microscopia confocale per assicurarsi che il carico sia centrato (fare riferimento al passaggio 6 per le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione utilizzate).
5. Formulazione del carico
NOTA: La formulazione Polybubble può ospitare vari tipi di carico, tra cui piccole molecole, proteine e acidi nucleici.
- Sulla base di studi precedenti, nel caso del carico proteico, utilizzare eccipienti tra cui polietilenglicole (PEG), polivinilpirrolidone (PVP) e glicopolimeri per migliorare la stabilità delle proteine durante la formulazione in polibolle.
- Formare polibolle in base al protocollo del passaggio 2.
- Preparare la soluzione antigenica aggiungendo 17,11 g di trealosio a 625 μl di antigene HIV gp120/41.
- Iniettare manualmente 1 μL di soluzione antigenica al centro della polibolla.
- Aprire le polibolle nei giorni 0, 7, 14 e 21 e registrare la fluorescenza dell'antigene con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 497 nm e 520 nm.
- Determinare la funzionalità dell'antigene utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e utilizzare il 5% di latte scremato come tampone bloccante.
6. Rilascio del carico
NOTA: Una piccola molecola o antigene può essere utilizzato come tipo di carico
- Piccola molecola
- Incubare le polibolle con acriflavina centrata in 400 μL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) a 37 °C, 50 °C per le polibolle PLGADA e a 37 °C, 50 °C, 70 °C per le polibolle PCL/PCLTA.
nota: Il motivo per cui consigliamo di testare temperature superiori a quelle corporee è a) simulare la temperatura (50 °C) alla quale raggiunge la polibolla durante il lasering delle nanobarre d'oro (AuNR) all'interno di PCL e PLGA; e b) accelerare il processo di degradazione del PCL (50 °C, 70 °C).
- Ad ogni momento, raccogliere i surnatanti e sostituirli con 400 μl di PBS fresco.
- Utilizzare un lettore di piastre per quantificare le intensità di fluorescenza nei surnatanti raccolti.
nota: Utilizzare ex/em di 416 nm/514 nm per l'acriflavina.
- antigene
- Incubare le polibolle con siero di albumina bovina centrato (BSA)-488 in 400 μL di PBS a 37 °C, 50 °C per le polibolle PLGADA e a 37 °C, 50 °C per le polibolle PCL/PCLTA.
- Ad ogni momento, raccogliere i surnatanti e sostituirli con 400 μl di PBS fresco.
- Utilizzare un lettore di piastre per quantificare le intensità di fluorescenza nei surnatanti raccolti. Utilizzare ex/em di 497 nm/520 nm per BSA-488.
nota: Lo studio del rilascio a 70 °C per le polibolle PCL/PCLTA non deve essere condotto per evitare di esporre l'antigene a temperature estreme.