Un test per valutare gli effetti antitumorali del surnatante libero da cellule di Lactobacillus

Abstract

Fonte: Lee, J., et al. Valutazione della morte cellulare utilizzando il surnatante privo di cellule di probiotici in colture sferoidi tridimensionali di cellule tumorali del colon-retto. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un test in vitro per studiare gli effetti antitumorali del surnatante libero da cellule di Lactobacillus (LCFS). Dopo aver esposto gli sferoidi del cancro del colon-retto a dosi variabili di LCFS, l'interazione con i metaboliti batterici in LCFS induce l'apoptosi nelle cellule tumorali, interrompendo la struttura sferoidale e portando alla morte cellulare in modo dose-dipendente.

Protocollo

1. Colture cellulari batteriche e preparazione del surnatante libero da cellule di Lactobacillus (LCFS)

NOTA: Le fasi 1.2 – 1.9 vengono condotte in una camera anaerobica.

1. Preparare una piastra di agar De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) e un brodo contenente L-cisteina e sterilizzare in autoclave.
2. Pre-incubare la piastra di agar MRS in camera anaerobica H₂ mantenuta a 37 °C con 20 ppm di ossigeno.
3. Scongelare il ceppo batterico di Lactobacillus e inoculare la piastra di agar con la coltura batterica (Figura 1A (i)).
4. Incubare i batteri per 2 - 3 giorni in camera anaerobica H₂ a 37 °C e 20 ppm di ossigeno fino ad ottenere singole colonie batteriche.
5. Lavare e asciugare la provetta per coltura anerobica di tipo Hungate. Autoclavare la provetta di coltura a 121 °C per 15 minuti.
6. Quindi incubare la provetta in camera anaerobica H₂ a 37 °C e 20 ppm di ossigeno per rimuovere l'ossigeno.
7. Mettere 2 - 3 ml di brodo MRS nella provetta. Sigillare il tubo con un tappo di gomma butilica e avvitare il tappo.
8. Ottenere una singola colonia con un ansa e inserirla nella provetta di coltura da 1,5 ml con 500 μl di 1x PBS. (Figura 1A (ii)).
9. Sospendere la colonia utilizzando una siringa da 1 ml (Figura 1A (iii)). A tale scopo, inserire l'ago della siringa da 1 mL al centro del coperchio del tubo, aspirare la colonia sospesa e quindi risospenderla nel terreno di brodo MRS. (Figura 1A (iv)).
10. Incubare il terreno di distillazione MRS in un'incubatrice con agitatore per 2 giorni (37 °C, 5% CO₂, 200 giri/min).
11. Misurare la densità ottica (OD) utilizzando uno spettrofotometro per monitorare le curve di crescita batterica fino a quando l'assorbanza a OD₆₂₀ raggiunge 2,0.
12. Separare i pellet batterici e il terreno condizionato centrifugando a 1.000 x g per 15 minuti. Lavare i pellet batterici raccolti con 1x PBS e risospendere in 4 mL di RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino. Non includere antibiotici nel terreno.
13. Mantenere i pellet batterici in RPMI e incubare in un incubatore shaker per 4 ore a 37 °C con il 5% di CO₂ ad una velocità di 100 giri/min.
14. Per la preparazione del surnatante probiotico, rimuovere il pellet batterico mediante centrifugazione a 1000 x g, per 15 minuti a 4 °C. Filtrare sterilemente il surnatante recuperato utilizzando un filtro da 0,22 μm e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.

2. Generazione di sferoidi

1. Preparazione di linee cellulari di cancro del colon-retto
   1. Coltivare le linee cellulari DLD-1, HT-29 e WiDr in monostrati fino alla confluenza del 70-80% e incubare la piastra a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ (terreno di crescita: RPMI contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina).
   2. Per le cellule coltivate in piastra di Petri da 100 mm, lavare la piastra due volte con 4 mL di 1x PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare la piastra di Petri per 2 minuti a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per dissociare le cellule.
   3. Dopo l'incubazione, controllare la dissociazione cellulare al microscopio e neutralizzare la tripsina-EDTA con 5 mL di terreno di crescita.
   4. Trasferire le cellule dissociate in una provetta conica da 15 mL e centrifugare per 3 minuti a 300 x g.
   5. Scartare il surnatante e risospendere delicatamente con 3 mL di terreno di coltura.
   6. Contare le cellule con il blu di tripano per determinare le cellule vitali utilizzando un emocitometro. (Figura 1B (i))
2. Formazione di sferoidi
   1. In una provetta conica da 15 mL, diluire le cellule da 2.1.5 per ottenere 1 - 2 x 10⁵ cellule/mL (Figura 1B (ii))
   2. Aggiungere la concentrazione finale di metilcellulosa allo 0,6% alla sospensione cellulare e trasferire le cellule diluite in un serbatoio sterile.
      NOTA: Per ogni linea cellulare, la quantità di metilcellulosa necessaria deve essere titolata e determinata di conseguenza.
   3. Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 200 μl di cellule in ciascun pozzetto di una micropiastra a fondo tondo a 96 pozzetti con attacco ultrabasso. (Figura 1B (iii))
   4. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 24 - 36 ore.
   5. Dopo 24 - 36 ore, osservare la lastra al microscopio ottico per garantire la formazione di sferoidi.

3. Trattamento delle cellule tumorali del colon-retto 3D con LCFS

1. Generare sferoidi come descritto nei passaggi 2 e 3.
2. Prima di eseguire il trattamento LCFS, scongelare l'LCFS congelato a temperatura ambiente (RT) per 10 - 20 minuti.
3. Inoculare la soluzione madre LCFS in un terreno di coltura. Diluire in serie al 25%, 12,5% e 6% nel terreno di crescita (ovvero, 25% LCFS = 150 μL di terreno di crescita + 50 μL di LCFS).
4. Estrarre la piastra di coltura cellulare contenente gli sferoidi dall'incubatore e rimuovere la maggior parte possibile del terreno di crescita da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta da 200 μl.
5. Aggiungere il terreno di coltura con LCFS sulle cellule e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 24 - 48 h.
   nota: Il volume da utilizzare dipenderà dalle dimensioni della piastra come segue: 2 mL per piastre per colture cellulari a 6 pozzetti; 200 μl per piastre per colture cellulari a 96 pozzetti.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica della formazione degli sferoidi e della preparazione di LCFS.

(A) Le immagini di rappresentazione schematica del protocollo di generazione LCFS sono contrassegnate da (i-iv) (B) Gli schemi della formazione di sferoidi mediata da metilcellulosa sono contrassegnati da (i-iii).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Applied Biosystems MicroAmp Pellicola adesiva ottica	Thermo Fisher Scientifico	4311971	100 copertine
Provetta per microcentrifuga Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock, polipropilene, trasparente, non sterile, 500 provette/confezione, 10 confezioni/confezione	Corning	SCT-200-C	500 tubi/confezione, 10 confezioni/confezione
BD Difco Bacto Agar	Bd	Codice 214010	500 g
BD Difco Lattobacilli MRS Brodo	Bd	DF0881-17-5	500 g
Soluzione salina tamponata con fosfato Corning, 1X senza calcio e magnesio, PH 7,4 ± 0,1	Corning	21-040-CV	500 ml
Provetta Falcon 5 mL in polistirene a fondo tondo, con tappo a scatto per filtro cellulare	Corning	352235	25/Confezione, 500/Cassa
Siero fetale bovino, certificato, origine statunitense	Thermo Fisher Scientifico	16000044	500 ml
Lactobacillus fermentum	Raccolta coreana per le culture tipo	KCTC 3112
L-cisteina cloridrato monoidrato	Sigma-Aldrich	Codice C6852-25G	25 g
Metilcellulosa (3500-5600mPa·s, 2% in acqua a 20°C)	TCI	Codice: M0185	500 g
Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzetti MicroAmp con codice a barre, 0,1 mL	Biosistemi Applicati	4346906	20 piastre
Millex-GS Unità filtro per siringa, 0.22 μm, esteri misti di cellulosa, 33 mm, sterilizzato con ossido di etilene	Millipore	SLGS033SB	250
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientifico	15140122	100 ml
RPMI-1640	Gibco	Codice: 11875-119	500 ml
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	Thermo Fisher Scientifico	25200056	100 ml
Materiali/Attrezzature/Software
Incubatore a CO2	Thermo fisher	HERAcell 150i
Tubo conico 15 ml	Spl	Codice: 50015
Tubo conico 50 ml	Spl	Codice: 50050
Corning Costar Piastra a pozzetti multipli con attacco ultrabasso	Sigma-Aldrich	CLS7007
Corning Costar Piastra a pozzetti multipli con attacco ultrabasso	Sigma-Aldrich	CLS3471
Serbatoi per reagenti Costar da 50 mL, 5/sacca, sterili	Costar	4870
Countess Cell Counting Camera Vetrini	Thermofisher	Codice: C10228
Contacellule automatizzato Countess II FL	Invitrogen	AMQAF1000
Lettore multimodale EnSpire	Perkin Elmer		Ispira 2300
Pipetta multicanale Eppendorf Research Plus, 8 canali	Eppendorf	3122000051
Agitatore incubato	Compagno di laboratorio	SIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,	Fujifilm		Tokyo, Giappone
Spettrofotometri UV/Vis LAMBDA a densità ottica	Perkin Elmer		Waltham, MA, Stati Uniti
Microscopio a contrasto di fase	Olimpo		Tokyo, Giappone
Provetta per microcentrifuga SPL 1,5mL	Spl	Codice 60015
Serbatoi multicanale SPL, 12 canali, PS, sterili	Spl	21012
Processori di liquidi ad ultrasuoni Vibra-Cell	SONICS-cella vibrante	VC 505	Processore ad ultrasuoni da 500 Watt
Camera anaerobica in vinile	PRODOTTI COY LAB